Padronização e validação do método de microdiluição para determinação da concentração inibitória mínima de compostos antimicrobianos

Abstract

Resumo: A crescente preocupação com o aparecimento de bactérias multirresistentes e a necessidade de se buscar novos compostos com atividade antimicrobiana, exigem, com fundamental importância, o desenvolvimento e o aprimoramento de técnicas capazes de determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de antimicrobianos. A determinação da CIM pode ser realizada por técnicas de diluição em caldo (macrodiluição e microdiluição), e atualmente, a técnica de microdiluição vem sendo amplamente utilizada por economizar meios de cultura, reagentes e, também, por utilizar pequenas quantidades dos compostos a serem testados. Outra vantagem do uso da microdiluição é a facilidade em adquirir, simultaneamente, grande quantidade de dados. No entanto, não existe uma padronização da técnica de microdiluição, principalmente com relação à utilização de indicadores de crescimento microbiano, ao tipo de leitura utilizado e às condições de incubação empregadas. Essa falta de harmonização da metodologia pode acarretar em diferenças na determinação da CIM dos compostos. Também não está descrito na literatura um método colorimétrico capaz de transformar valores de absorbância obtidos por leitura espectrofotométrica em concentração de micro-organismos viáveis (UFC/mL). Diante desse quadro, o objetivo do presente trabalho foi a padronização e validação de um método de microdiluição colorimétrico e quantitativo capaz de determinar a CIM de compostos antimicrobianos. Para tanto, após pesquisas na literatura, o cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC) foi selecionado como indicador de crescimento ideal. Para definir a concentração a ser utilizada, foram realizados testes para verificar a toxicidade e a sensibilidade do TTC frente aos micro-organismos testados: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Candida albicans (ATCC 10231). Após ensaios preliminares em tubos, as condições estabelecidas para o método foram: a utilização de solução de TTC 0,125% (p/v), adicionada após 22 horas de incubação à 35°C, seguida de mais 2 horas de incubação e subsequente leitura em espectrofotômetro. O método foi validado e demonstrou linearidade (R2>0,95), precisão (DPR <26 %), exatidão (75 % a 122 %) e robustez. Os parâmetros validados garantem a harmonização da metodologia para determinar não somente a CIM como também as concentrações inibitórias de 50 % (CI50%) e 90 % (CI90%) dos micro-organismos. Além disso, em razão da fácil inserção na rotina laboratorial e devido à economia de espaço, de tempo, e de meios de cultura, sugere-se a aplicação do método padronizado e validado para a investigação de compostos com potencial atividade antimicrobiana provenientes das mais diversas fontes. Palavras-chave: Validação; Microdiluição; Cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC); Quantificação de micro-organismos.

Abstract: The growing concern with the emergence of multi-resistant bacteria and the investigation of new compounds with antimicrobial activity, the development of new methodologies to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of antibiotics is fundamental importance. The MIC assay can be performed using broth dilution techniques (macrodilution and microdilution), and currently, the microdilution has been widely used for saving culture media, reagents and using small amounts of compounds for testing. Another advantage is the easier way to acquire large amount of data simultaneously. In fact, there is no standardization of microdilution method, mainly regarding about growing indicators, the reading and the incubation conditions. This absence of methodology harmonization can lead in differences on MIC of the compounds. Furthermore, in the literature it is not described a colorimetric method able to transform absorbance values obtained by spectrophotometric reading to concentration of viable organisms (CFU / mL). In this context, the major purpose of this work was to develop and validate a microdilution colorimetric method able to determine the MIC of antimicrobial compounds. Therefore, after searching on the literature, 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) was selected as optimal growing indicator. In order to set the concentration, several tests were carried out, to verify the toxicity and the sensibility of the TTC against the following microorganisms: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) and Candida albicans (ATCC 10231). After preliminary tests on tubes, the conditions defined for the method were: using a TTC solution of 0,125% (w / v), added after 22 hours of incubation at 35 °C followed by further 2 hours of incubation and subsequent reading in spectrophotometer. The method was validated and showed linearity (R2> 0.95), precision (RSD <26 %), accuracy (75 % to 122 %) and robustness. The validated parameters have ensure the harmonization of the methodology to determine not only the MIC, but also the inhibitory concentration of 50 % (IC50%) and of 90 % (IC90%) of microorganisms. Moreover, due the easier insertion in the laboratory routine and because of the economy of space, time, and culture media, we suggest the implementation of standardized and validated method for the investigation of compounds with potential antimicrobial activity from the most diverse sources. Keywords: Validation; Microdilution; 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC); Quantification of microorganisms.