Desenvolvimento e validação de método por LC-MS/MS para determinação multiresíduos de fármacos em ovos

Abstract

Resumo: Fármacos veterinários são amplamente utilizados na avicultura de postura tanto para o tratamento de diferentes doenças quanto como promotores do crescimento. A presença de resíduos de medicamentos veterinários em ovos é um problema de saúde pública, pois o consumo desse alimento contaminado pode desencadear reações alérgicas e ainda contribuir para o desenvolvimento de espécies resistentes de bactérias. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) para a detecção e quantificação simultânea de 22 drogas veterinárias em ovos, contemplando 8 classes farmacológicas (tetraciclinas, sulfonamidas, coccidiostáticos, macrolídeos, lincosamidas, benzimidazóis, diterpenos e diaminopirimidinas). As análises foram conduzidas em um cromatógrafo acoplado a um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo, operando com interface electrospray no modo positivo de ionização. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna XBridge BEH C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 ?m, Waters, EUA) acoplada a uma pré-coluna XBridge BEH C18 (10 x 2,1 mm, 3,5 ?m, Waters, EUA), ambas mantidas a 35 ?C. A fase móvel foi eluída a 400 ?L min-1 no modo gradiente entre água e metanol/acetonitrila (20:80 v/v), ambos contendo 0,1% de ácido fórmico. As amostras foram preparadas através da técnica de precipitação de proteínas com acetonitrila. O extrato obtido foi diluído com acetato de sódio 5 mmol L-1/acetonitrila/metanol (70:24:6 v/v/v) e uma alíquota de 10 ?L foi injetada no cromatógrafo. Os resultados de validação mostraram que o método é seletivo e livre de efeito residual e de matriz. O método apresentou baixos limites de detecção (0,37 a 7,5 ?g kg-1) e de quantificação (1,25 a 20 ?g kg-1). Para substâncias proibidas, os valores de limite de decisão (CC?) e capacidade de detecção (CC?) ficaram entre 0,62 a 7,5 ?g kg-1 e 0,65 a 8,1 ?g kg-1, respectivamente. Para substâncias com limite máximo de resíduo permitido, os valores de CC? e CC? ficaram entre 2,15 a 1061,5 ?g kg-1 e 2,3 a 1135,9 ?g kg-1, respectivamente. As curvas de calibração apresentaram uma excelente correlação (r?0,99) para todos os analitos ao longo dos diferentes intervalos de concentração. A recuperação dos analitos e padrões internos (49,0 a 103,7%) foi obtida com elevada precisão (CV<8%). Nos diferentes níveis de concentração as variações de precisão e exatidão, em termos de repetibilidade e reprodutibilidade intra-laboratorial, foram <11%. O método validado foi aplicado com sucesso para determinar resíduos de medicamentos veterinários em quinze amostras de ovos comerciais. Somente uma amostra estava contaminada com resíduos de doxiciclina, sulfametoxazol e trimetoprim, os quais tem o uso proibido em animais cujos ovos sejam produzidos para consumo humano. Esse método é aplicável para análises de rotina e pode ser implementado nos planos nacionais de controle de resíduos, contribuindo para a segurança alimentar da população. Palavras-chave: medicamentos veterinários, análise de resíduos, ovos, cromatografia líquida, espectrometria de massas

Abstract: Veterinary drugs are widely used in laying poultry both for the treatment of different diseases and as growth promoters. The presence of veterinary drug residues in hen eggs is a public health problem, because the consumption of this contaminated food can cause allergic reactions and contribute to the development of resistant strains of bacteria. The present work aimed to develop and validate a method for high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for detection and simultaneous quantification of 22 veterinary drugs in eggs, contemplating 8 classes (tetracyclines, sulfonamides, coccidiostats , macrolides, lincosamides , benzimidazole , diterpenes and diaminopyrimidines). Analyses were conducted on a chromatograph coupled to a triple quadrupole mass spectrometer operating in electrospray positive ion mode. Chromatographic separations were achieved on XBridge BEH C18 column (150 x 2.1 mm, 3.5 ?m, Waters, EUA) coupled with a XBridge BEH C18 guard column (10 x 2.1 mm, 3.5 ?m, Waters, EUA), both maintained at 35 ?C. The mobile phase was eluted at 400 ?L min-1 in the gradient mode between water and methanol/acetonitrile (20:80 v/v), both containing 0.1% formic acid. The samples were prepared by protein precipitation with acetonitrile. The extract was diluted with sodium acetate 5 mmol L-1/ acetonitrile/methanol (70:24:6 v/v/v) and an aliquot of 10 ?L was injected into the chromatograph. Data from validation studies demonstrated that the new method is highly selective and free of matrix and residual effects. The method presented low limits of detetion (0.37 a 7.5 ?g kg-1) and quantification (1.25 a 20 ?g kg-1). For banned substances, decision limit values (CC?) and detection capability (CC?) were between 0.62 to 7.5 ?g kg-1 and 0.65 to 8.1 ?g kg-1, respectively. For substances with maximum residue limit allowed, the CC? and CC? values were between 2.15 to 1061.5 ?g kg-1 and 2.3 to 1135.9 ?g kg-1, respectively.The calibration curves showed excellent correlation (r?0.99) for all analytes along different concentration ranges. The recovery of the analytes and internal standards (49.0 to 103.7%) was reached with high precision (CV<8%). In the different levels of concentration the variations of precision and accuracy, in terms of repeatability and within-laboratory reproducibility, were <11%. The validated method was successfully applied to determine the veterinary drug residues in fifteen commercial egg samples. Only one sample was contaminated with residues of doxycycline, sulfamethoxazole and trimethoprim, which are prohibited for use in animals from which eggs are produced for human consumption. This method is applicable to routine analysis and can be implemented in the national residue control plans, contributing to the food security of the population. Keywords: veterinary medicines, residue analysis, eggs, liquid chromatography, mass spectrometry