Purificação, características cinéticas e isoenzimas da lactato desidrogenase (L-Lactato: NAD+ oxidoredutase, E.C.1.1.1.27) do músculo epaxial de curimbata, Prochilodus scrofa, Steindachner, 1881, e de Notothenia neglecta (Pisces, Teleostei)

Abstract

Resumo: Foi realizado estudo comparativo de purificação, propriedades cinéticas e distribuição tecidual de lactato desidrogenase (L-Lactato : NAD+ oxidorredutase, E.C. 1.1.1.27) de músculo epaxial de peixes, Prochilodns scropha, uma espécie tropical e Notothenia neglecta, uma espécie antártica. A purificação da LDH foi levada a efeito em cromatografia por afinidade de oxamatoagarose, tendo sido possível obter valores satisfatórios de purificação. Para o estudo cinético a LDH foi purificada por precipitação com sulfato de amónio a 70%, centrifugada e dialisada. Em LDH de ambas as espécies estudou-se o efeito da concentração hidrogeniónica, a LDH apresenta pH ótimo em torno de 6,5 a 7,5 e 6,6 a 7,0, para P. scropha e N. neglecta, respectivamente. A energia de ativação foi de 7.591 e 6.567 cal/mol para P. scropha e N. neglecta, respectivamente. O estudo do efeito da temperatura sobre o KN! da LDH para o piruvato foram os seguintes: para LDH de P. scropha : 0,09mM, 0,13mM e 0,13mM de piruvato a 10°C, 20°C e 30°C, respectivamente; para LDH de N. neglecta. os valores de Km em diferentes temperaturas foram :0,24mM, 0,3lmM e 0,33mM de piruvato a 10°C, 20°C e 30°C, respectivamente. O efeito do pH nos valores de Km de ambas as preparações de LDH foram as seguintes: para LDH de P. scropha. 0,048mM, 0,046mM e 0,144mM de piruvato em pH 6,0, 7,0 e 8,0, respectivamente; para LDH de N. neglecta: os valores de Km nos diferentes pH foram os seguintes: 0,044mM, 0,153mM e 0,277mM de piruvato em pH 6,0, 7,0 e 8,0, respectivamente; Ambas as preparações de LDH foram sensíveis quando incubadas a altas temperaturas, incubação por 30 minutos a 50°C causou acentuada inativação da LDH de ambas as fontes. Com relação aos inibidores, o oxalato atua como inibidor não competitivo tanto para LDH de P. scropha como para LDH de N. neglecta. Por outro lado, oxamato aparenta ser inibidor incompetitivo para ambas as preparações de LDH. O APAD - 3-acetilpiridina adenina dinucleotídeo, é um potente inibidor das preparações de LDH, sendo a LDH de N. neglecta mais sensível do que a LDH de P. scropha. O perfil eletroforético de ambas as preparações mostraram, em acetato celulose, uma única faixa de proteína. Entretanto, em tampão barbital, pH 8,6, a LDH de P. scropha migra para o cátodo enquanto que a LDH de N. neglecta migra para o ânodo.

Abstract: It has been carried out a comparative study on the purification, tissue distribution and kinetic properties of the lactate dehydrogenase (Llactate: NAD+ oxidoreductase, E.C.I. 1.1.27) from the epaxial muscle of the tropical fish Prochilodus scropha and the Antarctic fish Notothenia neglecta. Purification of LDH from both sources was carried out either by salting out with 70% sat. ammonium sulfate or by oxamate-agarose affinity chromatography. The following kinetic properties were experimentally established for the LDH preparations form both biological sources: optimum pH, 6.5 - 7.5 (P. scropha) and 6.6 - 7.0 (TV. neglecta; energy of activation according to Arrhenius: 7.591 Kcal/mol for LDH from P. scropha and 6.567 Kcal/mol, for LDH from N. neglecta; values for Km at different temperatures were as follows: for LDH from P. scropha: 0.09mM, 0.13mM and 0.13mM pyruvate at 10°C, 20°C and 30°C, respectively; for LDH from N. neglecta, values for KM at different temperatures were as follows: 0.24mM, 0.3 ImM and 0.33mM pyruvate at 10°C, 20°C and 30°C, respectively. The effect of pH on the Km values of both preparations of LDH was also assayed giving the following results: for LDH from P. scropha: 0.048mM, 0.046mM and 0.144mM pyruvate at pH 6.0, 7.0 and 8.0 respectively; for LDH from N.neglecta, 0.044mM, 0.153mM and 0.277mM pyruvate at pH 6.0, 7.0 and 8.0 respectively. Both preparations of LDH were very sensitive to incubation at high temperatures. Incubation for 30 minutes at 50°C causes appreciable heat inactivation of both preparations. According to the experiments carried out, oxalate acts as a non-competitive inhibitor for both preparations of LDH from P. scropha and from N. neglecta. On the other hand, oxamate seems to inhibit both preparations of LDH as an incompetitive inhibitor. APAD = 3, acetyl pyridineadenine dinucleotide, on its turn, is a powerful inhibitor of these LDH preparations, the LDH from N. neglecta being much more sensitive to it than de LDH preparation from P. scropha. The eletrophoretic profile of these LDH preparation showed in cellulose acetate showed a single band of protein for either preparation. However, it has been found that in barbital buffer, pH 8.6, the LDH from P. scropha migrates towards the cathode while the LDH from N. neglecta migrates towards the anode.