Investigação de biomarcadores indicativos da evolução do acidente vascular encefálico através de RMN aliada a quimiometria
Abstract
Resumo: Estratégias metabonômicas baseadas em análises de RMN de biofluidos têm sido utilizadas com eficácia no diagnóstico e prognóstico de doenças, além de auxiliar na compreensão de mecanismos patológicos. Uma patologia de grande impacto na sociedade atual é a doença vascular encefálica, a qual ainda é a principal causa de óbitos no Brasil por doenças cerebrovasculares e a maior causa de incapacidade neurológica no mundo. Dentre os casos de DVE, 80 a 85% são de origem isquêmica. Neste sentido, espectros de RMN de 1H e 31P{1H} foram obtidos em um espectrômetro de RMN Bruker de 400 MHz a partir de amostras de soro e plasma sanguíneo de pacientes que sofreram acidente vascular encefálico isquêmico nas primeiras 24 horas após a ocorrência e ao longo de seis meses. Paralelamente foram coletadas amostras de pacientes saudáveis para comparação com os pacientes doentes. As análises foram realizadas após se estabelecer o método de preparo das amostras e os parâmetros espectrais. Estudos de estabilidade mostraram que as amostras de soro sanguíneo são bastante sensíveis a mudanças de temperatura e pouco estáveis quanto maior a temperatura em que foram expostas. Os espectros de RMN de 1H apresentaram o perfil característico de amostras de soro ou plasma, apresentando sinais de colesterol, lipídeos e lipoproteínas, aminoácidos, glicoproteínas, ácidos orgânicos, açúcares, além de outros metabólitos. Os resultados das análises quimiométricas para as amostras de plasma foram menos satisfatórios do que para as análises com as amostras de soro, provavelmente devido aos sinais de EDTA e derivados. As análises quimiométricas, realizadas em dois programas computacionais diferentes, permitiram perceber discriminação entre grupos doente e controle principalmente para os períodos iniciais após o AVEi, demonstrando o potencial da técnica em diagnosticar a doença nas primeiras horas ou dias. Os principais metabólitos que sofreram alterações foram colesterol, leucina, isoleucina, alanina, acetoacetato, piruvato, glutamina, colina e derivados, fosfolipídios, fosfatos inorgânicos, glucose, tirosina, histidina, fenilalanina, hipoxantina e formato. Modelos de classificação desenvolvidos a partir dos espectros de RMN de 31P{1H} mostraram boas sensibilidade e especificidade. Análises das amostras de pacientes que receberam ou não tratamento trombolítico indicaram diferentes mecanismos metabólicos após a administração do medicamento, inclusive mostrando um efeito benéfico do mesmo. Também foi possível perceber alterações específicas dos pacientes que sofreram óbito. Portanto, a abordagem metabonômica baseada em dados de RMN de 1H e 31P mostrou ter grande potencial no diagnóstico do AVEi e em auxiliar na melhor compreensão dos mecanismos desencadeados pela doença e pelo tratamento trombolítico. Abstract: NMR-based metabonomic analyzes of biofluids has been successfully used in the diagnosis and prognosis of disease, as well as in the understanding of pathological mechanisms. Cerebral vascular disease is a pathology of great impact in society today, which is still the leading cause of death in Brazil due to cerebrovascular diseases and the leading cause of neurological disability worldwide. Among the cases of cerebral vascular disease, 80-85% is of ischemic origin. Accordingly, 1H and 31P{1H} NMR spectra were obtained in a spectrometer Bruker of 400 MHz from serum and plasma of patients who suffered ischemic stroke within the first 24 hours of the occurrence and in the course of six months. Samples from healthy patients were also collected for comparison with disease patients. Analyses were performed after settling the method of sample preparation and spectral parameters. The stability studies showed that samples of serum are sensitive to changes in temperature and less stable the higher the temperature at which were exposed. The 1H NMR spectra showed characteristic profile of serum or plasma, showing signals of cholesterol, lipids and lipoproteins, amino acids, glycoproteins, organic acids, sugars and other metabolites. The results of the chemometrics analyzes for plasma samples were less satisfactory than for analysis with the serum, probably due to signals from EDTA and derivatives. The chemometric analysis performed on two different computer programs, allowed discrimination between disease and control groups mainly for initial periods after ischemic stroke, demonstrating the potential of the technique in diagnosing the disease in the first hours or days. The principal metabolites which have been altered included: cholesterol, leucine, isoleucine, alanine, acetoacetate, pyruvate, glutamine, choline and derivatives, phospholipids, inorganic phosphate, glucose, tyrosine, histidine, phenylalanine, hypoxanthine and formate. Classification models developed from the 31P{1H} NMR spectra showed very good sensitivity and specificity. Analysis of samples from patients who had received thrombolytic therapy or not indicate different metabolic pathways after administration of the drug, even showing a beneficial effect of same. It was also possible to detected specific changes of patients who had died. Therefore, the metabonomics approach based on data of 1H and 31P NMR have shown great potential in the diagnosis of ischemic stroke and assist in better understanding of the mechanisms triggered by the disease and thrombolytic therapy.
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