Participação de Endocanabinóides, Arginina-Vasopressina e Endotelina-1 em um modelo de sepse severa (CLP) em ratos

Abstract

Resumo: Estudos prévios demonstraram que a endotelina-1(ET-1) reduziu a frequência de correntes excitatórias espontâneas em células magnocelulares de ratos através da ativação de receptores ETA. Como se obteve uma redução na frequência de disparo e não na amplitude das correntes, esses dados sugeriram um efeito pré-sináptico. Além disso, o antagonista canabinóide CB1 aboliu esse efeito sugerindo um envolvimento dos endocanabinóides (eCB). Estudos anteriores demonstraram também que durante a sepse ocorre um aumento nos níveis de eCB e ET-1. Deste modo aventamos a hipótese de que durante a sepse severa, a ET-1 por meio da ativação do receptor ETA induz uma liberação de eCB, os quais causariam uma diminuição dos níveis de arginina vasopressina (AVP), e isso poderia contribuir para o aumento da mortalidade nesta condição clínica. A sepse foi induzida em ratos Wistar machos (180-200g) por ligação e punção do ceco (CLP). Uma curva de sobrevida utilizando 1, 3 e 9 furos foi feita com o objetivo de determinar o número de furos necessários para induzir sepse severa. Na curva de sobrevida, os ratos com 1,3 e 9 furos, apresentaram uma taxa de sobrevida de 84%, 26% e 0%, respectivamente. O número de furos escolhido para os experimentos subsequentes foi 3. Nos experimentos subsequentes, os animais foram tratados com antagonista do receptor CB1 rimonabanto (10 mg/kg ou 20 mg/kg, p.o.) 4 h após a CLP ou antagonista de receptor ETA BQ123 (100 pmol i.c.v.), 2h e 4h, 4 e 8 h, e 8 h após a CLP ou com antagonista de receptor ETB BQ 788 (100 pmol, i.c.v.), 4 e 8 h após a CLP e a sobrevida foi analisada por 7 dias. Os animais tratados com Rim (10 mg/kg e 20 mg/kg) apresentaram um aumento na taxa de sobrevida em relação ao grupo CLP/veículo. No tratamento com BQ 123, 2 e 4h ou 8 h após a CLP, os animais não apresentaram um aumento na taxa de sobrevida. Por outro lado, no tratamento com BQ123 4 e 8 h após a CLP, houve um aumento significativo na taxa de sobrevida em relação ao grupo controle (CLP/veículo). Diferentemente, o tratamento dos animais com BQ788, 4 e 8 h após a CLP não modificou a taxa de sobrevida dos animais. Para a medida da temperatura corporal (Tc), 5 dias antes da CLP, registradores de temperatura foram implantados na cavidade peritoneal dos animais. A Tc foi medida em intervalos de 30 min, 2 h antes até 12 h após a CLP. Na avaliação da temperatura, a CLP induziu um aumento da temperatura corporal dos animais e o rimonabanto reduziu este aumento a níveis similares àqueles observados para o grupo falso-operado. Para a avaliação da migração celular, após o tratamento com antagonista de receptor CB1 ou com veículo foi realizada a coleta do exsudato peritoneal dos animais 8 h após a CLP e posteriormente foi feita a contagem global e diferencial de leucócitos. A CLP induziu um aumento significativo na migração de leucócitos, particularmente neutrófilos para a cavidade peritoneal dos animais. O tratamento dos animais com rimonabanto não alterou a migração celular para o peritôneo. Ainda, foi realizada a coleta de sangue dos animais por punção cardíaca 2, 4, 6, 8 e 12 h após a CLP, juntamente com o tratamento dos animais com rimonabanto 4 h após a CLP ou com BQ123 4 e 8 h após a CLP. O número de leucócitos circulantes foi avaliado em todos os tempos, enquanto que os níveis circulantes de interleucina-6 (IL-6) foram avaliados 6 e 8 h após a CLP e os níveis de AVP foram avaliados 6, 8 e 12 h após a CLP. Não foram encontradas diferenças significativas no número de leucócitos circulantes 2 h após a CLP. Na contagem global e diferencial de leucócitos circulantes 4h após a CLP foi observado neutropenia do grupo CLP/veículo em relação ao sham e após 6h foi observado leucopenia decorrente de neutropenia e linfopenia do grupo CLP/veículo. O tratamento com rimonabanto não modificou nenhum destes parâmetros. Em relação à dosagem de IL-6, 6 e 8 h após a CLP houve um aumento nos níveis plasmáticos de IL-6 e o tratamento dos animais com rimonabanto também não modificou este aumento. Na avaliação da dosagem de AVP, após 12 h os grupos CLP/Rim e CLP/BQ123 apresentaram aumento dos níveis de AVP comparado aos grupos CLP/Veículo. Para a análise estatística das curvas de sobrevida foi realizado teste de log rank. Para os testes de migração, leucometria, níveis de AVP e níveis de IL-6 foi realizada ANOVA de uma via seguido pelo teste de Bonferroni, enquanto que para os testes de temperatura foi utilizada ANOVA de duas vias seguido do teste de Bonferroni. Estes dados sugerem que o bloqueio de receptores CB1 e de receptores centrais ETA previne a mortalidade induzida por CLP em ratos. O bloqueio dos receptores CB1, não alterou respostas periféricas como migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal, contagem global e diferencial de leucócitos e níveis de IL-6 mas reduziu a resposta febril e alterou os níveis de AVP no plasma sugerindo uma ação central desse antagonista. Nossos resultados mostram que o bloqueio de receptores centrais ETA e CB1 aumentam os níveis de AVP na fase tardia da sepse induzida por CLP e este efeito está relacionado a um aumento da sobrevida dos animais após a administração desses antagonistas. Palavras-chaves: sepse, endocanabinóides, arginina-vasopressina e endotelina-1.

Abstract: Previous studies have shown that endotelin-1 (ET-1) was able to reduce the frequency of spontaneous excitatory currents in magnocellular cells of rats through activation of ETA receptors. As there was a reduction in the firing frequency and not at the amplitude of the currents, the data suggested a presynaptic effect. Further, the CB1 antagonist abolished this inhibitory effect suggesting the involvement of endocannabinoids (eCB). Previous studies also demonstrated that during sepsis there was an increased of ET-1 and eCB levels. Thus we hypothesized that during severe sepsis, ET-1 through the activation of the ETA receptor induces a release of eCB, which would cause a decrease in the levels of arginine vasopressin (AVP), and this could contribute to increased mortality in this condition. Sepsis was induced in Male Wistar rats (180-200g) by cecal ligation and puncture (CLP). A survival curve was performed using 1, 3 and 9 punctures in order to determine the number of punctures needed to induce severe sepsis. In the survival curve, the animals with 1, 3 and 9 punctures presented a survival rate of 84 %, 26 % and 0 %, respectively. The number of punctures chosen for the subsequent experiments was 3. In subsequent experiments, animals were treated with CB1 receptor antagonist rimonabant (Rim, 10 mg/kg or 20 mg/kg, by oral route) 4 h after CLP or receptor antagonist BQ123 ETA (100 pmol icv), 2h and 4h, 4 and 8 h and 8 h after CLP or ETB receptor antagonist BQ 788 (100 pmol, icv), 4 and 8 h after CLP and survival was assessed for 7 days. Animals treated with Rim (10 mg/kg and 20 mg/kg) showed an increase in survival compared to the CLP group / vehicle. In the treatment with BQ 123, 2 and 4 h or 8 h after CLP, the animals did not show an increase in survival. Moreover, in the treatment with BQ123, 4 h and 8 h after CLP, there was a significant increase in survival compared to the control group (CLP/vehicle). In contrast, treatment of animals with BQ788, 4 and 8 h after CLP did not alter the survival rate of the animals. To measure body temperature (Tc), 5 days before CLP, temperature recorders were implanted in the peritoneal cavity of animals. The Tc was measured at intervals of 30 min, 2 h before until 12 h after CLP. In assessing the temperature, CLP induced an increase in body temperature of the animals and Rimonabant reduced this increase to levels similar to those observed in the sham group. For the assessment of cell migration after treatment with CB1 receptor antagonist or with vehicle, collecting the peritoneal exudate of the animals was performed 8 h after CLP and the global leukocyte count and differential was performed. The CLP induced a significant increase in the migration of leukocytes, particularly neutrophils into the peritoneal cavity of the animals. Treatment with rimonabant did not alter the cell migration into the peritoneum. The collection of blood from the animals by cardiac puncture 2, 4, 6, 8 and 12 h after CLP was performed, along with the treatment of animals with rimonabant, 4 h after CLP or BQ123, 4 and 8 h after CLP. The number of circulating leukocytes was assessed at all times while circulating levels of interleukin-6 (IL-6) were evaluated 6 and 8 h after CLP and levels of AVP were evaluated 6, 8 and 12 h after CLP. Treatment with rimonabant did not modify any of these parameters. Regarding IL-6, 6 and 8 h after CLP there was an increase in plasma levels of IL-6 and rimonabant treatment of animals also did not change with this increase. In assessing the dosage of AVP, 12 h after CLP, CLP/Rim and CLP/BQ123 groups showed increased levels of AVP compared with CLP/vehicle group. For statistical analysis of survival curves was performed log rank test. For tests of cell migration, leukocyte count, and measurement of AVP and IL-6 one- way ANOVA followed by Bonferroni test was performed. And for temperature, two-way ANOVA followed by Bonferroni test was used. We have shown in this study that the blockage of CB1 receptors and central ETA receptors prevented the mortality induced by CLP in rats. These data suggest that blockade of central CB1 receptors and ETA receptors prevent CLP-induced mortality in rats. Blockade of CB1 receptors, did not alter peripheral responses such as neutrophil migration into the peritoneal cavity, global and differential leukocyte count and IL-6 but reduced the febrile response and altered levels of AVP in plasma suggesting a central action of this antagonist. Our results show that the blockage of central ETA and CB1 receptors and increase levels of AVP in the late phase of CLP induced sepsis and this effect is related to an increased survival of the animals after administration of these antagonists. Keywords: Sepsis, endocannabinoids, arginine vasopressin and endotelin-1