Aplicação do micrométodo espectrofotométrico para a determinação de azul de Evans em plasma e tecido colônico de ratos Wistar

Abstract

Resumo: O presente estudo objetiva estandardizar um micrométodo para quantificar azul de Evans e possibilitar sua determinação em plasma e cólon de ratos para estabelecer o fluxo transcapilar normal do corante desde o compartimento vascular ao tecidual. Na primeira fase do estudo estabeleceu-se a calibração da solução padrão do azul de Evans a 2,5% diluída em diversas proporções em plasma de ratos e em solução fisiológica a 0,9 %, através da leitura espectrofotométrica em leitor de microplacas de ELISA. Obteve-se, as curvas padrões de calibração que permitiram a relação entre as densidades ópticas e as concentrações do corante. Para as determinações teciduais, utilizou-se solução fisiológica como branco e para as plasmáticas, plasma normal de ratos. Apresentaram respectivamente 0,98424 e 0,99539 como coeficiente de correlação ( r ) para as calibrações. A outra fase do estudo consistiu na inoculação intravenosa, através da veia peniana, de 20 mg/kg do azul de Evans em 96 ratos Wistar, divididos segundo os períodos de avaliação, em 12 grupos de 8 animais cada. As avaliações plasmáticas e teciduais foram executadas durante o período de 16 dias, distribuídas a partir da inoculação do corante em. 15', 30', 60', 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 32 h, 2 d, 4 d, 8d e 16 d, com obtenção de amostras de plasma e fragmentos colônicos, sendo estes colocados em formamida, na proporção de 4 ml/g de tecido. Após a obtenção das densidades ópticas das amostras de plasma e cólon, foram interpolados os valores nas curvas padrões de calibração. Os valores obtidos demonstraram que o máximo de transferência do corante ao tecido colônico ocorre 8 horas após a inoculação com o valor médio de 148,3 µg/ml de plasma e 48,32 µg/g de tecido colônico. Os resultados obtidos permitiram concluir que foi possível estandardizar o micrométodo espectrofotométrico que serviu para determinar as concentrações do azul de Evans em plasma e tecido colônico de ratos, após sua inoculação intravenosa.

Abstract: The aim of this study is to standardize a micro method to quantify Evans blue and to determine its presence in plasma and colon of rats, to establish the normal transvascular flux of the dye from the vascular compartment to the colonic tissue. As the first step of the procedure the micro method was standardize, through the calibration of the standard solution of 2,5% of Evans blue, diluted in different proportions with plasma and saline solution, in a micro plate reader of ELISA. The standard curves of calibration were obtained relating optical density and dye concentration. For the tissue determination, a saline solution was used as blank solution and for the plasma, normal rat plasma was used. The correlation coefficient of the calibrations were 0,98424 and 0,99539 respectively. The second step of the study was the intravenous injection through the penis vein of 20 mg/kg of Evans blue in 96 Wistar rats, divided in 12 groups of 8 rats each, according to the time of evaluation. The plasmatic and tissular evaluations were performed during a 16 day period, from the time of inoculation and every 15', 30', 60', 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 32 h, 2 d, 4 d, 8 d and 16 d, obtaining plasma samples and colonic fragments. The colonic fragments were preserved in formamide ( 4 ml/g ) for extraction of the dye. After the optical densities of plasmatic and colonic samples were obtained, the values were put on the standard calibration curve. The values obtained showed that the maximum transference of dye in the colonic tissue happened at the 8th hour postinoculation with a mean value of 148,3 µg/ml in plasma and 48,32 µg/g in the colonic tissue. These results allowed to conclude that it was possible to standardize the spectrophotometric micro method, which permited to determine the concentration of Evans blue in plasma and colonic tissue of Wistar rats, after intravenous injection.