Desenvolvimento de imunoensaio para determinar a atividade das fosfatases alcalinas placentária (PLAP) e PLAP-símile em amostras de soro e tecido de pacientes oncológicos

Abstract

Resumo: A identificação de marcadores tumorais continua sendo um desafio no diagnóstico de neoplasias, e dependendo da sensibilidade e especificidade existirão importantes implicações para a terapêutica e prognóstico. Fosfatase alcalina placentária (hPLAP) e PLAP-símile são marcadores tumorais expressos em neoplasia de ovário, testículo, pulmão, trato gastrointestinal e tumor adrenocortical (TCA). Em condições fisiológicas, PLAP é produzida a partir da 12ª semana de gestação e PLAP-símile é produzida em baixíssimos níveis, em testículo, cérvix, timo, que se elevam em fumantes. As isoformas das fosfatases alcalinas (ALPs) humanas são (1) ALP placentária (hPLAP) e (2) PLAP-símile, termoestáveis e com 98% de homologia entre si; (3) ALP intestinal (IAP) e (4) tecido não específico (TNAP), termolábeis e com 88% e 56% de homologia com relação à PLAP, respectivamente. O objetivo deste estudo foi desenvolver dois imunoensaios para detecção da atividade catalítica (ICA) da hPLAP/PLAP-símile com anticorpos anti-hPLAP produzidos em ovelha. Foi elaborado um imunoensaio provavelmente capaz de reconhecer todas as isoformas de PLAP e PLAP-símile (ICA-PLAP), produzido com anticorpos policlonais purificados em coluna de Sepharose® ligada a hPLAP, e outro com anticorpos policlonais que reconhecem um epítopo de PLAP (ICA-PEP), purificados com coluna de Sepharose® ligada ao peptídeo sintético AA 57-71 da seqüência de hPLAP. As metodologias foram padronizadas e validadas com hPLAP e IAP comerciais, amostras de soro de 93 doadores de sangue (não fumantes e fumantes), soro de gestantes e de uma paciente com carcinoma embrionário de ovário, e tecidos de placenta e TCA. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram 6,5% e 9,9% para o ensaio ICA-PLAP e 3,7% e 9% para o ensaio ICA-PEP. A recuperação variou de 96,1% a 98,4%, e de 97,1% a 103,9% para os ensaios ICA-PLAP e ICA-PEP, respectivamente. Em ambos os ensaios, a sensibilidade foi igual a 0,1 U/l e o valor de corte igual a 0,2 U/l para não fumante e fumante ocasional, enquanto os resultados preliminares sugerem que níveis de PLAP/PLAP-símile acima de 0,4 U/l em fumantes podem eventualmente revelar uma neoplasia. Os ensaios ICA-PLAP e ICA-PEP apresentaram um boa correlação (r=0,94). Reação cruzada foi observada numa concentração de IAP de 50 g/ml (equivalente a 27,5 U/l) no ensaio ICAPLAP, e de 100 g/ml no ICA-PEP (equivalente a 55 U/l e que correspondeu a um resultado de 0,4 U/l, o que seria obtido com apenas 36 ng/ml de PLAP, ou seja, uma concentração cerca de 2800 vezes menor). As atividades de PLAP/PLAP-símile nas amostras de soro da paciente com carcinoma embrionário de ovário diminuiu com a redução do tamanho da massa tumoral no primeiro ciclo de antineoplásicos. Em 77% (17/22) das amostras de tecido de TCA, as atividades de PLAP/PLAP-símile estavam acima do valor de referência obtido para o soro de indivíduos saudáveis (0,2 U/l), porém estes experimentos precisam ser reavaliados em relação ao quadro clínico e comparando-se com a atividade em córtex adrenal normal. Os ensaios ICAPLAP e ICA-PEP e os resultados obtidos com os pacientes, sem incluir a atividade de IAP, permitiram concluir que há alguns tipos de tumores que podem ser precocemente detectados usando soro ou amostras de tecido. Palavras-chave: fosfatase alcalina placentária, marcadores tumorais, imunoensaio catalítico.

Abstract: The search for a tumor marker continues to be a challenging issue for cancer diagnosis, and its sensitivity and specificity often have important therapeutic and prognostic implications. PLAP and PLAP-like are tumor markers expressed in malignancies from ovary, testis, lungs, adrenocortical tumors (TCA) and gastrointestinal tract tumors. At phisiological conditions, hPLAP is produced by placenta after the twelth week of pregnancy and PLAP-like by normal thymus, fetal and neonatal testis, and normal endocervix at very low levels, and their levels increase dramatically in smoking individuals. The human alkaline phosphatase (ALP) consisted of a family of four isozymes. Human placental ALP (hPLAP) and PLAP-like, which are stable at 65oC and present 98% homology; intestinal ALP (IAP) and nonspecific tissue ALP (TNAP) or liver/bone/Kidney ALP, which are not active at 65oC and present 88% and 56% homology with PLAP, respectively. The main goal of this study was to develop two enzymatic immunoassays for PLAP/PLAP-like determination using antibodies produced in sheep: one immunoassay capable of recognizing all possible PLAP and PLAP-like proteins using a policlonal antibody (ICA-PLAP) purified in affinity-column (Sepharose® bound to hPLAP) and the second immunoassay (ICA-PEP) designed to recognize a small part of PLAP (AA 57-71). A standard protocol for both assays was stablished and afterwards they were tested with commercial hPLAP and IAP, using serum samples from 93 adult individuals (including smoking and non-smoking ones), sera from pregnant women and a patient with ovary embryonal carcinoma, as well as, tissue samples from placenta and childhood TCA. Intra- and inter-assay coefficients of variation were 6,5% and 9,9% for ICA-PLAP, and 3,7% and 9% for ICA-PEP, respectively. The recovery ranged from 96,1% to 98,4%, and from 97,1% to 103,9% for ICA-PLAP and ICA-PEP, respectively. The working range was from 0.1 U/l to 11 U/l for both assays. PLAP/PLAP-like in serum of non-smoking and apparently normal adult individuals was found up to 0,2 U/l, while smoking individuls seem to present an upper cut-off level of 0,4 U/l. Beyond these values it is recommended to search for neoplastic tissue. Data obtained using the ICA-PLAP assay correlated well to ICA-PEP (r=0.94). Cross-reactivity with IAP was observed at high IAP concentrations, 50 g/ml (or 27,5 U/l) using ICA-PLAP, and higher concentration (100 g/ml, or 55 U/l) for ICA-PEP (exhibiting only 0,4 U/l, in contrast with 36 ng/ml that would be required for PLAP to reach the same result, which is almost 2800 times less concentrated). Identification of PLAP/PLAP-like activity in a girl with ovary embryonal carcinoma that diminished with tumor size after first cycle of chemotherapy indicated that these assays are efficient and important for follow-up. Using these assays, it was found that 77% (17/22) of the tested TCA tissue samples expressed either PLAP or PLAP-like, however, further research is necessary to better quantify and characterize according to clinical conditions of children. The ICA-PLAP and ICA-PEP assays and the results obtained from patients, without including IAP activity, allowed to conclude that there are subsets of tumors that may be precociously detected using either serum or tissue samples. Key words: placental alkaline phosphatase, tumor markers, catalytic immunoassay.