Obtenção de carotenoides utilizando a bactéria Halorubrum saccharovorum (archaea)

Abstract

Resumo: Os carotenoides são pigmentos que apresentam funções relacionadas à saúde, atuando na prevenção de doenças e também são aplicados nas indústrias alimentícia, farmacêutica e cosmética, atuando como corantes e antioxidantes. Diversos organismos são capazes de produzir carotenoides, entre eles estão os halofílicos do domínio Archaea. Dessa forma, a bactéria halofílica Halorubrum saccharovorum, pertencente ao domínio Archaea, foi cultivada para a investigação da sua composição de carotenoides por espectrofotometria, cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em fase líquida de alta eficiência hifenada a espectrometria de massas (CLAE-EM) e por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H). Essas análises foram realizadas no extrato seco obtido a partir da extração com acetona dos pigmentos das células secas do micro-organismo. Os resultados obtidos nas análises de CLAE-EM e RMN de 1H evidenciaram a presença no extrato do carotenoide bacterioruberina, que possui 50 átomos de carbono e apresenta alta atividade antioxidante, além de outros compostos isoprenoides. Portanto, a existência da bacterioruberina no extrato foi confirmada pela presença dos íons de m/z 741, 723, 705 e 687 [M+H]+ nos espectros de massas extraídos do cromatograma obtido, bem como dos sinais de deslocamento químico na região de 5,4 a 6,8 ppm e das constantes de acoplamento características do esqueleto isoprenoide da bacterioruberina no espectro de RMN de 1H. Com isso, um protocolo para obtenção e identificação de carotenoides produzidos pela bactéria Halorubrum saccharovorum foi desenvolvido. Uma vez que foi confirmada a produção de pigmentos carotenoides, como a bacterioruberina, pela bactéria Halorubrum saccharovorum, um planejamento fatorial 24 completo foi realizado. Nesse planejamento foram avaliados os efeitos dos fatores pH, temperatura, velocidade de agitação e tempo de cultivo na produção de biomassa e de carotenoides totais. Os resultados do planejamento fatorial foram analisados por meio do software Minitab 7.0 e evidenciaram a existência de interações estatisticamente significativas de segunda e de terceira ordem. Os principais fatores que afetaram positivamente a formação de células e a produção de carotenoides pela bactéria Halorubrum saccharovorum foram o pH de 7,5 e a temperatura de 37°C, fornecendo concentração de células entre 2,2 e 2,4 g.L-1 e concentração de carotenoides entre 72 e 90 ?g de carotenoides por grama de células secas.

Abstract: Carotenoids are pigments that present functions related to health, acting in disease prevention, and have applications in food, pharmaceutical and cosmetic industry, acting as colorants or antioxidants. Different microorganisms are capable of producing carotenoids, including the halophilic microorganisms of the Archaea domain. Therefore, the halophilic bacterium Halorubrum saccharovorum belonging to the Archaea domain was cultivated for the investigation of its carotenoid composition by spectrophotometry, thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) and 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H RMN). These analyses were performed in the acetone dry extract of the pigments of Halorubrum saccharovorum dry cells. The results from the HPLC-MS and 1H NMR analyses evidenced the presence in the extract of the carotenoid bacterioruberin, that possesses 50 carbon atoms and presents high antioxidant capacity, beyond other isoprenoid compounds. Therefore, bacterioruberin existence in the extract was confirmed by the presence of the ions presenting m/z 741, 723, 705 e 687 [M+H]+ in the mass spectra extracted from the obtained chromatogram in addition to the chemical shifts in the region of 5.4 to 6.8 ppm and the coupling constants characteristics of the bacterioruberin isoprenoid skeleton in the 1H NMR spectrum. In this way, a protocol for the achievement and identification of carotenoids produced by the bacterium Halorubrum saccharovorum was developed. Once it was confirmed the production of carotenoid pigments, as bacterioruberin, by the bacterium Halorubrum saccharovorum, a 24 full factorial design was accomplished. In this design, it were evaluated the effects of pH, temperature, stirring speed and culture time in biomass and total carotenoid formation. The factorial design results were analyzed using Minitab 7.0 statistical software and showed the existence of second and third order interactions statistically significant. The main factors that affected positively the formation of cells and the production of carotenoids by the bacterium Halorubrum saccharovorum were pH of 7.5 and temperature of 37°C, providing the cell concentration between 2.2 and 2.4 g.L-1 of dry cell and the total carotenoid concentration between 72 and 90 ?g of total carotenoids per gram of dry cells.