Caracterização da vitelogênese em Rhamdia quelen e sua aplicação no monitoramento de desreguladores endócrinos

Abstract

Resumo: A vitelogenina (VTG) é uma glicolipofosfoproteína expressa pelas fêmeas de ovíparos em resposta ao hormônio endógeno 17?estradiol (E2). Machos ovíparos somente expressam essa proteína quando expostos ao E2 ou a compostos que mimetizem o mesmo. Alguns poluentes provenientes do despejo industrial, urbano e resíduos da atividade agrícola possuem estrutura semelhante a do E2, sendo capazes de afetar o sistema endócrino sendo considerados desreguladores endócrinos, levando machos a expressarem a VTG. Visto o aumento destes poluentes no ambiente natural e o seu potencial tóxico, torna-se necessário caracterizar processos e moléculas indicadores deste tipo de disfunção. Frente a tal cenário, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar o processo de vitelogênese e a molécula de vitelogenina expressa por machos de Rhamdia quelen, produzir anticorpos policlonais que reconheçam a vitelogenina da espécie em questão e a aplicação dos mesmos no biomonitoramento de reservatórios de abastecimento de água urbanos. Para a caracterização do processo de vitelogênese machos de R. quelen foram injetados com E2 e comparados a fêmeas naturalmente vitelogênicas e machos adultos. Após 15 dias de exposição tecidos chaves para o processo de vitelogênese foram coletados e analisados. O fígado demonstrou aspecto vacuolizado tanto em fêmeas quanto em machos expostos ao E2, sendo tais vacúolos compostos de lipídeos. O teor de carboidratos também se apresentou aumentado em machos estrógeno induzidos. Indivíduos expostos ao estrógeno apresentaram ainda um aumento no índice hepatossomático e não apresentaram alteração no índice gonadossomático. As gônadas de fêmeas e machos controle apresentaram morfologia padrão para tal tecido; já nos machos expostos as gônadas apresentaram-se em estágio iniciais de maturação. Verificou-se no plasma a presença de uma molécula, de alta massa molecular, estrógeno induzível em machos e naturalmente presente em fêmeas que foi caracterizada como uma glicolipofosfoproteína. A espectrometria de massa não identificou a proteína, porém verificou-se alta similaridade entre o mapa de massas peptídicas da molécula considerada como vitelogenina das fêmeas e dos machos induzidos. Através de ensaios de western blot foi possível identificar tal proteína como sendo a vitelogenina. Técnicas imunológicas também foram utilizadas para marcar a vitelogenina no fígado e nas gônadas de machos expostos e fêmeas. Tais resultados demonstram que a vitelogenina é produzida no fígado, secretada para a corrente sanguínea e incorporada às gônadas. Para a produção dos anticorpos policlonais, machos adultos de R. quelen foram injetados com 10 mg EE2.kg-1 (17?etinil-estradiol). A VTG foi isolada diretamente do gel de poliacrilamida e coelhos machos foram imunizados. A especificidade dos anticorpos produzidos foi verificada por western blot, imuno-histoquímica e imunofluorescência. Para avaliar a presença de desreguladores endócrinos nos reservatórios do Iraí e do Passaúna, animais da espécie em questão foram mantidos por 3 e 6 meses, em tanques redes em cada um dos reservatórios. Em ambas as exposições e em ambos os reservatórios não foi detectada a VTG no plasma de machos adultos, indicando que nestes reservatórios não há poluentes que afetem o sistema endócrino da espécie estudada, ou a quantidade de poluentes existentes não foram capazes de induzir tal resposta.

Abstract: Vitellogenin (VTG) is a glicolipophosphoprotein expressed by oviparous females in response to endogenous hormone 17?estradiol (E2). Oviparous males only express this protein when exposed to E2 or compounds that mimic it. Some pollutants from urban sewage, industrial and agriculture dumps have a structure similar to E2, being able to affect the endocrine system and therefore considered endocrine disruptors, turning males to express VTG. Considering the increase of these pollutants in natural environment and its potential toxicity, it is necessary to characterize processes and molecules as indicators of endocrine dysfunction. Considering the previous scenario described, the aim of this study is to characterize the process of vitellogenesis and vitellogenin molecule expressed by males of Rhamdia quelen, producing polyclonal antibodies that recognize the vitellogenin of this specie and applying them in biomonitoring water urban reservoirs for human supply. To characterize the process of vitellogenesis males of R. quelen were injected with E2 and compared with naturally vitellogenic females and adult males. After 15 days of exposure important tissue for the vitellogenesis processes were collected and analyzed. Liver showed vacuolated aspect in both males exposed to E2 and females, and these vacuoles where lipid composed. The carbohydrate content also showed increased in males estrogen-induced. Individuals exposed to estrogen showed a further increase in hepatosomatic index and no change in the gonadosomatic index. The gonads of males and females controls showed normal morphology, whereas in males exposed, gonads were in the initial stage of maturation. It was found in plasma the presence of a molecule with high molecular mass, estrogen inducible in males and naturally present in females and it was characterized as a glicolipophosphoprotein. Mass spectrometry did not identify the protein, but it showed a high similarity between the structure of the female protein and male induced protein. Through western blot assays this protein was identified as vitellogenin. Immunological techniques were also used to locate the vitellogenin in liver and gonads of exposed males and females. These results demonstrate that vitellogenin is produced by liver, secreted into the bloodstream and incorporated into the gonads. For the production of polyclonal antibodies, adult males of R. quelen were injected with 10 mg EE2.kg-1 (17?etinil-estradiol). VTG was isolated directly from the polyacrylamide gel and male rabbits were immunized. The specificity of the antibodies produced was verified by western blot, immunohistochemistry and immunofluorescence. To evaluate the presence of endocrine disruptors in the Iraí and Passaúna water reservoirs, animals were exposed for 3 and 6 months in fish cages in both reservoirs. In both expositions and in both reservoirs VTG was not detected in plasma of adult males, leading us to believe in the absence of pollutants that affect the endocrine system of this specie in these two water reservoirs.