Caracterização genotípica e patogenicidade de Bacillus Cereus isolados de produtos lácteos

Abstract

Resumo

Resumo: Bacillus cereus é um micro-organismo ubiquitário, formador de esporo, capaz de sobreviver à pasteurização e a maioria dos processos térmicos aplicados em leites e derivados. Além disso, é patogênico e causador de quadros distintos quando veiculado por alimentos contaminados. Este trabalho teve como objetivo verificar a frequência dos genes de patogenicidade de Bacillus cereus isoladas de leite e produtos lácteos, provenientes de estabelecimentos comerciais e de diferentes marcas nacionais comercializados no Brasil. Um total de 260 amostras de produtos foram analisadas e divididas da seguinte maneira: 100 amostras de leite pasteurizado obtidas de 18 marcas, 50 amostras de leite em pó obtidas de 16 marcas e 110 amostras de leite UHT obtidas de 19 marcas. Após cultivo microbiológico as culturas isoladas foram submetidas a testes morfológicos e bioquímicos para identificação de B. cereus. Foram isoladas 63 culturas do micro-organismo, sendo que 36 foram oriundas de leite pasteurizado, 15 de leite em pó e 12 de leite UHT. Os isolados bacterianos foram então testadas para a presença dos genes codificantes das toxinas hemolisina BL (HBL), enterotoxina não-hemolítica (NHE) e citotoxina K (CytK), responsáveis pela síndrome diarréica, e para a toxina cereulida causadora da síndrome emética. A detecção das toxinas foi feita através da técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR) que verificou a presença dos genes: hblA, hblC e hblD (componentes da HBL), nheA, nheB e nheC (componentes da NHE), cytK (gene que codifica a CytK), cytK-1 e cytK-2 (formas diferentes da CytK) e ces (gene que codifica a cereulida). Para a PCR foram utilizados primers e temperaturas de pareamento específicas para cada gene avaliado. Dentre os 63 isolados de B. cereus os resultados obtidos, em termos percentuais, para a detecção de cada gene foram: hblA: 41,27%, hblC: 53,97%, hblD: 53,97%, nheA: 65,08%, nheB: 23,81%, nheC: 82,54%, cytK: 68,25, cytK-1: não encontrado (NE), cytK-2: 61,90% e ces: 3,17%. Os resultados obtidos referentes às culturas isoladas do leite pasteurizado são: hblA: 44,44%, hblC: 69,44%, hblD: 69,44%, nheA: 83,33%, nheB: 33,33%, nheC: 75,00%, cytK: 80,55%, cytK-1: NE, cytK-2: 75,00% e ces: 2,78%. Para o leite em Pó: hblA: 66,66%, hblC: 60,00%, hblD: 60,00%, nheA: 80,00%, nheB: 20,00%, nheC: 93,33%, cytK: 86,66%, cytK-1: NE, cytK-2: 80,00% e ces: 6,66%. E os resultados para o leite UHT foram: hblA: NE, hblC: NE, hblD: NE, nheA: NE, nheB: NE, nheC: 91,66%, cytK: 8,33%, cytK-1: NE, cytK-2: NE e ces: NE. Para a verificação da presença da toxina diarréica hemolisina BL foi utilizado o kit diagnóstico BCET-RPLA da marca Oxoid®, foram submetidas ao teste as culturas que apresentaram os três componentes formadores da HBL (genes hblA, hblC e hblD). Dos 63 isolados 23 apresentaram os genes hblACD e 20 foram positivas ao teste de expressão, gerando um percentual de 86,96%. Para os produtos separadamente os percentuais de detecção da toxina foram: leite pasteurizado: 92,85% e leite em pó: 88,88%. Nenhuma cepa proveniente de leite UHT apresentou os genes hblACD.

Abstract: Bacillus cereus is an ubiquitous, spore-forming bacteria that can survive pasteurization and the majority of the heating processes used in the dairy industry. Besides, it is a pathogen responsible for different types of food poisoning. The aim of this work was to evaluate the frequency of pathogenic Bacillus cereus isolates from milk and dairy products obtained from commercial establishments from different brands marketed in Brazil. A total of 260 product samples were analyzed and the distribution of them were: 100 samples of pasteurized milk from 18 brands, 50 samples of powdered milk from 16 brands and 110 samples of UHT milk from 19 brands. After microbiological culture the samples were tested, morphologically and biochemically, for the identification of B. cereus. 63 isolates of the microorganism were obtained and from that total 36 were isolated from pasteurized milk, 15 from powdered milk and 12 from UHT milk. The strains were tested for the presence of the encoding genes for hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) and cytotoxin K (CytK), the causative agents of the diarrheal syndrome and for cereulide, responsible for the emetic syndrome. The toxins detection was carried through polymerase chain reaction (PCR) that verified the presence of the genes: hblA, hblC and hblD (sub-units of the HBL), nheA, nheB and nheC (sub-units of the NHE), cytK (gene that express the CytK), cytK-1 and cytK-2 (different forms of CytK) and ces (gene that express the cereulide). PCR were carried with specific set of primers and annealing temperatures for each evaluated gene. From the 63 isolated B. cereus cultures the results, in percentage, were: hblA: 41,27%, hblC: 53,97%, hblD: 53,97%, nheA: 65,08%, nheB: 23,81%, nheC: 82,54%, cytK: 68,25, cytK-1: not found (NF), cytK-2: 61,90% and ces: 3,17%. Of the 36 pasteurized milk isolates the results were: hblA: 44,44%, hblC: 69,44%, hblD: 69,44%, nheA: 83,33%, nheB: 33,33%, nheC: 75,00%, cytK: 80,55%, cytK-1: NF, cytK-2: 75,00% and ces: 2,78%. For powdered milk: hblA: 66,66%, hblC: 60,00%, hblD: 60,00%, nheA: 80,00%, nheB: 20,00%, nheC: 93,33%, cytK: 86,66%, cytK-1: NE, cytK-2: 80,00% and ces: 6,66%. And for UHT milk the results were: hblA: NF, hblC: NF, hblD: NF nheA: NF, nheB: NF, nheC: 91,66%, cytK: 8,33%, cytK-1: NF, cytK-2: NF and ces: NF. The expression of the diarrheal toxin HBL was evaluated using the BCET-RPLA toxin detection kit, Oxoid®. The strains tested were those carrying the three components of the HBL (genes hblA, hblC and hblD). From the 63 strains isolated 23 of them carried the hblACD genes and from that total 20 were positive in the toxin test kit , giving a 86,96% of strains producing the toxin. For group of products, the expression percentages were: pasteurized milk: 92,85% and powdered milk: 88,88%. None of the strains obtained from the UHT milk carried the hblACD genes.