Desenvolvimento e validação de um método por Clae-EM/EM para determinação simultânea de antiparasitários em associações de uso veterinário

Abstract

Resumo: Helmintiáses sao doenças parasitárias comumente encontradas nos animais e de importância para a saúde pública, uma vez que podem ser transmitidas aos seres humanos. Para o tratamento das helmintiáses, combinações de um ou mais fármacos com diferentes mecanismos de ação são necessários para aumentar o espéctro de ação bem como a eficácia no controle da infecção. Entre os principais antiparasitários, a ivermectina, o febantel, o praziquantel e o pamoato de pirantel são os mais utilizados. Combinações de dose fixa contendo esses fármacos são amplamente disponíveis no mercado, e o controle de qualidade desses medicamentos se torna importante, especialmente porque a administração de altas doses de ivermectina pode ser tóxica para os animais. Para atender a essa necessidade, nenhum método foi descrito para a quantificação simultanea da ivermectina, febantel, praziquantel e pamoato de pirantel em comprimidos. O presente trabalho trata do desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para determinação simultanea destas substâncias em comprimidos. As analises foram conduzidas em um cromatógrafo acoplado a um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo, operando com interface eléctrospray no modo positivo de ionização. As separações cromatográficas foram realizadas em uma coluna C8 (50 x 2,1 mm; 5 £gm) acoplada a uma pré-coluna C8 (10 x 2,1 mm; 5 £gm), ambas mantidas a 20„aC. A fase móvel foi eluída no modo isocrático a 200 ƒÝL.min-1 e consistiu em mistura 10:90 v/v de água e acetonitrila/agua (95:5 v/v), ambas contendo 0,1% de ácido fórmico e 3 mmol.L-1 de formiato de amônio. O volume de injeção foi de 20 ƒÝL. As amostras foram preparadas por pulverização dos comprimidos e a extração dos analítos foi obtida através de sonicação com acetonitrila/metanol (50:50 v/v). As soluções das amostras foram diluídas em fase móvel e o febantel, praziquantel e pamoato de pirantel foram diretamente analisados por CLAE-EM/EM. A ivermectina foi extraída da mistura de fármacos por extração em fase sólida utilizando cartuchos Oasis HLB. A eluição foi feita com 1 mL de acetonitrila e o eluato foi concentrado em um concentrador de amostras (40„aC) antes da injeção. O método validado apresentou excelentes coeficientes de correlação (r „d 0,99) para todas as curvas de calibração ao longo do intervalo de 40 a 200 ng.mL-1 para ivermectina, 20 a 100 ng.mL-1 para o febantel e pamoato de pirantel e 6 a 30 ng.mL-1 para o praziquantel. O intervalo de recuperação para o ensaio de exatidão foi de 93,26 a 101,36% com um DPR < 5% para a precisão intradia e interdia. O estudo da robustez indicou que variações na concentração de aditivos, proporção da fase móvel, temperatura e fluxo são críticas. Análises das amostras comerciais demonstraram uma falta de padronização nas quantidades desses antiparasitários, principalmente da ivermectina. O presente método e uma alternativa para o controle de qualidade de preparações farmacêuticas contendo ivermectina, febantel, praziquantel e pamoato de pirantel.

Abstract: Helminthiases are parasitic diseases commonly found in animals and it has public health importance since it can be transmissible to humans. For the treatment of helminthiases, combinations of more than one drug with different mechanisms of action are required to increase the spectrum of action as well as the effectiveness in the infection control. Among the main antiparasitics, ivermectin, febantel, praziquantel and pyrantel pamoate are the most commonly used. Fixed dose combinations containing these drugs are widely available in the market, and the quality control of these medicines becomes important, especially because the administration of high levels of ivermectin can be toxic for the animals. To meet this requirement, there is no reported method for simultanous quantification of ivermectin, febantel, praziquantel and pyrantel pamoate in tablets. The present work was devoted to the development and validation of a HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of these substances in tablets. Analyses were conducted on a chromatograph coupled to a triple quadrupole mass spectrometer operating in electrospray positive ion mode. Chromatographic separations were achieved on a C8 column (50 x 2.1 mm i.d; 5 £gm particle size) coupled with a C8 (10 x 2.1 mm i.d; 5 ƒÝm particle size) guard column maintained at 20 „aC. The isocratic mobile phase eluted at 200 £gL.min-1 consisted of 10:90 v/v of water and acetonitrile/water solution (95:5 v/v), both containing 0.1% formic acid and 3 mol.L-1 of ammonium formate.The injection volume was 20 £gL. Samples were prepared by powdering of the tablets and the analytes extraction was achieved with acetonitrile:methanol (50:50 v/v) by sonication. Sample solutions were diluted with mobile phase and febantel, praziquantel and pyrantel pamoate were directly analyzed by HPLC-MS/MS. Ivermectin was extracted from drugs mixture by solid-phase extraction using Oasis HLB cartridges. Elution was done with 1 mL acetonitrile and the eluate was concentrated in a sample concentrator (40 „aC) before injection. The validated method showed excellent coefficients of correlation (r „d 0.99) for all of the calibration curves over the ranges of 40 to 200 ng.mL-1 for ivermectin, 20 to 100 ng.mL-1 for febantel and pyrantel pamoate and 6 to 30 ng.mL-1 for praziquantel. The range of recovery was 93.26 to 101.36% with a RSD < 5% for intraday and interday precision. The robustness study indicated that variations in the additives concentration, mobile phase proportion, flow and temperature are critical. Analyses of commercial samples demonstrated a lack of standardization in the amounts of these antiparasitics, mainly of ivermectin. The presente method is an alternative for the quality control of pharmaceutical preparations containing ivermectin, febantel, praziquantel andpyrantel pamoate.