Caracterização funcional de TcDbp5 como componente da via de exportação de mRNA em Trypanosoma Cruzi

Abstract

Resumo: Em Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, o estudo de processos pós-transcricionais denota-se fundamentalmente importante, pois muitas das modificações celulares do parasita são decorrentes de um controle na expressão de genes que remodela o repertório de proteínas em cada estágio de seu ciclo de vida. Porém, algumas vias pós-transcricionais ainda são pouco compreendidas como o caso da via de exportação nucleocitoplasmática de RNA mensageiro. Dados recentes do nosso grupo de pesquisa demonstram que a via de exportação de mRNA é a menos conservada entre eucariotos e pouquíssimas proteínas apresentaram-se altamente conservadas. Baseados nisso, a caracterização funcional de TcDbp5 como um possível componente da via foi o objeto desse estudo, visto que está entre as proteínas altamente conservadas. As homólogas são descritas em outros organismos por interagir com proteínas do poro nuclear onde então atuam liberando o mRNA para a maquinaria da tradução. Assim, a busca de nucleoporinas em T. cruzi foi um dos enfoques, uma vez que TcDbp5 apresentou localização tanto no núcleo quanto no citoplasma com enriquecimento próximo ao complexo do poro. Pelas análises de associação com polissomos, foi possível observar que a localização no citoplasma não implicou em associação de TcDbp5 com a maquinaria de tradução. Porém, dados de microscopia por FISH sugerem que TcDbp5 está associada com RNA mensageiro no citoplasma. Pode ser que esta associação ocorra já no núcleo, pois análises de ultraestrutura mostraram que a proteína se encontra em regiões características de transcrição e processamento. Além disso, foi demonstrado através do tratamento com Leptomicina B, que especificamente interrompe a via Crm1 de transporte de proteínas, a capacidade de TcDbp5 migrar do núcleo para o citoplasma. Interessantemente, abordagens de imunoprecipitação permitiram demonstrar a interação de TcDbp5 com TcMex67, o receptor de transporte de mRNA. Em resumo, pressupõe-se que a atividade de TcDbp5 possa estar envolvida em vias de transporte de mRNA e para melhor compreensão da sua atuação e identificação de novos componentes da via é necessário investir em abordagens de enética reversa e proteômica.

Abstract: In Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas'disease, studies on post transcriptional processes are fundamentally important because most of cellular modifications of the parasite are due to gene expression control that changes the protein composition in each stage of its life cycle. However, some post-transcriptional pathways are poorly understood, such as the nucleocytoplasmic export of messenger RNA (mRNA). Recent data from our research group showed that mRNA export pathway is the least conserved in eukaryotes and few proteins are highly conserved. The goal of this study was the functional haracterization of TcDbp5, a possible component of this pathway, since it is one of the highly conserved proteins. The homologs are described by the interaction with proteins of nuclear pore, acting on the release of mRNA to translation. Searching for nucleoporins in T. cruzi was one of the approaches, because TcDbp5 showed nuclear and cytoplasmic localization with enrichment near to the nuclear pore complex. By olysomes association approach, it was observed that the cytoplasmic localization of TcDbp5 is not associated with the translation machinery. Nevertheless, microscopy analyses using FISH suggest that TcDbp5 is associated with mRNA in the cytoplasm. Probably, this association starts already inside the nucleus, since ultrastructural analyses showed that the protein is present in regions that are likely to be transcription and processing sites. Besides, it was demonstrated after Leptomycin B treatment, which blocks specifically the Crm1 transport protein, the ability of TcDbp5 in shuttling from nucleus to the cytoplasm. Interestingly, immnuoprecipitation showed the interaction of TcDbp5 with TcMex67, an mRNA export receptor. Taking together, it is assumed that the activity of TcDbp5 is related with mRNA transport pathways and to get urther into its function, and identification of novel components, is necessary to invest in genetic reverse and proteomic approaches.