Avaliação do Polimorfismo Gênico de MASP2 em pacientes com Hepatite C crônica

Abstract

Resumo: O vírus da hepatite C (HCV) infecta aproximadamente 170 milhões de pessoas ao redor do mundo e se tornou um grave problema de saúde pública. O HCV é um microorganismo hepatotrópico e a fibrose hepática é a principal complicação da hepatite C crônica, podendo evoluir para cirrose e heptocarcinoma. A Lectina Ligante de Manose (MBL) é uma colectina, codificada pelo gene MBL2 podendo agir como opsonina ou ativar Serinas Proteases associadas a MBL (MASPs) para iniciar a ativação da via das lectinas do complemento. Essa via é ativada quando moléculas de MBL/ficolinas ligam-se a unidade de manose ou outros carboidratos na superfície dos microorganismos. A ativação da via das lectinas resulta na clivagem de C4 e C2, induzindo a cascata do complemento com formação do complexo de ataque à membrana e consequente destruição do patógeno. MASP-2 apresenta estrutura molecular homóloga a C1r e C1s, clivando os componentes C4 e C2 para gerar C3 convertase. A ligação de alta afinidade MASP-2/MBL é dependente de cálcio e ocorre entre os domínios de colágeno da MBL e os domínios N-terminais CUB1-EGF-CUB2 da protease. Neste estudo analisou-se o polimorfismo do gene MASP2 em 104 pacientes Eurobrasileiros com hepatite C crônica (72 do gênero masculino e 32 do gênero feminino) e 104 controles saudáveis. Utilizou-se a técnica de PCR-SSCP e sequenciamento direto para amplificação da região codificadora do primeiro domínio (CUB1) e do quinto domínio (CCP2) do gene MASP2. Muitos desses pacientes (49%) eram portadores de cirrose hepática moderada ou grave e foram tratados com interferon associado à ribavirina. Foram identificados cinco polimorfismos presentes em pacientes e controles: p.R99Q (c.296G>A;rs61735600), p.D120G (c.359A>G;rs72550870), p.P126L (c.377C>T;rs56392418), p.D371Y (c.1111G>T;rs12711521) e p.V377A (c.11-30T>C;rs2273346). As frequências alélicas e genotípicas estão em equilíbrio de ligação de Hardy-Weinberg. Houve diferença estatisticamente significante entre pacientes e controles para o marcador p.D371Y (c.1111G>T) p=0,008. Considerando modelo de dominância de T para p.D371Y, os indivíduos com os genótipos G/G e G/T apresentaram maior risco de desenvolver hepatite C crônica (p=0,003, OR=6,33, IC=95%, 1,85-21,70). A análise in silico para determinação do efeito funcional, indicou que na presença do marcador p D120G (c.359A>G) pode ocorrer dano uncional à proteína e que na posição 371 o aminoácido aspartato (D) é bastante preservado entre as espécies. A concentração sérica de MASP-2 em pacientes com hepatite C portadores da variante p.D371Y (c.1111G>T) foi maior na presença do alelo G. Em relação à resposta ao tratamento com IFN, não houve diferença estatisticamente significante para os marcadores analisados: c.1111G>T e c.1130T>C. Não houve associação entre o grau de fibrose hepática e os marcadores analisados. Os resultados sugerem que a variante p.D371Y está associada com a susceptibilidade a hepatite C crônica e que na presença do alelo G, desse marcador, há aumento significante da concentração sérica de MASP-2.

Abstract: The hepatitis C virus (HCV) infects about 170 million people worldwide and has become a major public health issue. Fibrosis is the principal complication of chronic hepatitis C, which increases both morbidity and mortality due to complications such as cirrhosis or hepatocarcinoma. Mannan-binding lectin (MBL) is a collectin, encoded by the MBL2 gene that can act directly as opsonin or activate MBL-associated serine proteases (MASPs) initiating an antibody-independent pathway of complement activation. MASP-2 forms complexes with the pattern recognition molecules MBL and ficolins (H-ficolin, L-ficolin, or M-ficolin) and is activated when one of these proteins recognizes microorganisms leading to the subsequent cleavage of C4 and C2, thus initiating the activation of complement cascade. In this study we examined the MASP2 functional polymorphisms in 104 EuroBrazilian patients with chronic hepatitis C (72 men and 32 women), most patients were treated with conventional interferon associated with ribavirin, and 104 controls by PCR-SSCP. We using the primers set to amplify the region encoding first domain (CUB1) and fifth domain (CCP2) of this gene. We identified 5 polymorphisms (SNPs) in patients and controls: p.R99Q (c.296G>A;rs61735600), p.D120G (c.359A>G;rs72550870), p.P126L (c.377C>T;rs563-92418), p.D371Y (c.1111G>T;rs12711521), p.V377A (c.1130T>C; rs2273346). All alleles and genotype frequencies were consistent with those expected under the Hardy-Weinberg equilibrium. Upon comparison of the genotype frequency between patients and controls, only the variant p.D371Y (c.1111 G>T) reached statistical ignificance and was shown the presence of G allele is associated with chronic hepatitis C susceptibility, considering a dominant function of the T allele (p=0.003 – OR=6.33; CI 95%=1.85-21.70). The linkage disequilibrium was not detected between these five MASP2 polymorphisms (r2<0.8). Additional in silico analyses of these SNPs indicated that only p.D120G (c.359A>G) was predicted to provoke damage to the MASP-2 protein. We suggest that only the variant p.D371Y (c.1111 G>T), genotype G/G, possibly lead higher chronic hepatitis C susceptibility associated with high MASP-2 plasma levels in these patients. We analyzed of the response to IFN treatment into two positions c.1111G>T and c.1130T>C and no statistical significant were observed between two groups (p=0.550 and p=0.489, respectively). No association was found between allele c.1111G>T or c.1130T>C and degree of liver fibrosis. These results suggest that MASP-2 per se does not play an immunomodulatory role during treatment with IFN. MASP2 polymorphisms, particularly the variant p.D371Y, may therefore be associated with development of chronic C hepatitis.