Produção de domínios recombinantes da proteína ADAM23 e de anticorpos monocionais anti-ADAM23

Abstract

Resumo: Uma ADAM e uma proteina com aproximadamente 750 aminoacidos de comprimento e com multidominios, que incluem o pro-dominio, o dominio metaloprotease, o dominio desintegrina, o dominio rico em cisteina, o dominio semelhante a fator de crescimento epidermal (EGF-like), a regiao ransmembranica e a cauda citoplasmatica. A proteina ADAM23 (MDC3), dentro do seu dominio metaloprotease, nao possui o sitio ativo de aminoacidos para a ligacao de zinco, o qual e critico para a atividade proteasica. E altamente expressa no encefalo, mas e detectada apenas fracamente ou nao detectada em outros tecidos. Neste rabalho foram expressos satisfatoriamente os dominios recombinantes da proteina ADAM23 desintegrina e metaloprotease+desintegrina fusionados a GST em bacterias E. coli cepa DH5ƒ¿, mas so foi possivel purificar a proteina recombinante GST-desintegrina. Ja a proteina recombinante 6-His-desintegrina+rico em cisteina foi expressa mais significativamente em bacterias E. coli cepa BL21(DE3)STAR em comparacao om a cepa BL21(DE3)pLysS, e sua purificacao ocorreu de forma apropriada. A imunizacao de camundongos Balb/c com a proteina recombinante GST-desintegrina nao mostrou-se satisfatoria, enquanto a imunizacao com a proteina recombinante 6- His-desintegrina+rico em cisteina levou a producao de anticorpos policlonais especificos para ADAM23. Foi realizada uma fusao entre os esplenocitos de camundongo imunizado e celulas de mieloma, levando a obtencao de hibridomas. Apenas um hibridoma demonstrou-se secretor de anticorpos monoclonais especificos para ADAM23, entretanto nao apresentou estabilidade ompativel com a producao ilimitada e reprodutivel de anticorpos monoclonais.

Abstract: An ADAM protein have about 750 aminoacids of length and contains multidomains, which includes the prodomain, the metalloprotease domain, the disintegrin domain, the cystein rich domain, the epidermal growth factor like domain (EGF-like), the transmembranic region and the cytoplasmic tail. The ADAM23 (MDC3) protein does not contain the zinc-binding motif within the metalloprotease domain, which is critical for the protease activity. ADAM23 is highly expressed in the brain, but is weakly or not detected in other tissues. At the present work, the recombinat domains disintegrin and metalloprotease+disintegrin of the ADAM23 protein, fused to GST, were well expressed in E. coli DH5á, but only the GST-disintegrin protein could be purified. The recombinant protein 6-His-disintegrin+cystein rich was more expressed in E. coli BL21(DE3)STAR than in BL21(DE3)pLysS, and the purification occurred appropriately. The Balb/c mice immunization with the GST-disintegrin protein did not occurred satisfactorily, while the immunization with 6-His-disintegrin+cystein rich lead to the production of polyclonal antibodies specific for ADAM23. A fusion between the splenic cells from the immunized mice and the mieloma cells was performed to obtain hybridomas. Only one hybridoma secreted monoclonal antibodies specific for ADAM 3, however this hybridoma was not compatible to the ilimited and reproducible production of monoclonal antibodies, because of its instability.