Caracterização de isolados de Curvularia spp. Endofíticos de milho (Zea mays L.) por parâmetros morfológicos e moleculares

Abstract

Resumo: Fungos denominados dematiáceos causam a helmintosporiose ou manchas em diversas famílias de plantas, tendo uma grande importância para a cultura do milho. Os fungos dematiáceos do gênero Curvularia são encontrados com grande frequência em diferentes substratos vegetais, como saprofíticos, fitopatogênicos ou endofíticos, podendo ainda ser isolados a partir do solo e do ar. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial de plantas sadias de milho servirem como depositárias de espécies fúngicas patogênicas, especialmente a Curvularia, que é associada a diversas doenças em animais e vegetais. Foram isolados fungos de diferentes genótipos de milho, quatro parentais e três híbridos descendentes de cruzamentos destes parentais, da região de Campo Largo, PR. Também foram utilizados 22 isolados de Curvularia de Palotina, PR e dois isolados de Curitiba. Foram obtidos 23 isolados de Curvularia de três genótipos parentais: G4, G5 e G6, sendo o G5 o que forneceu o maior número de isolados (52%) e dos três genótipos híbridos (G1, G2 e G3). Do parental G7 não foi isolado Curvularia. Do híbrido G3 (G4 x G7) foi obtido apenas um isolado. Esses resultados sugerem uma colonização diferenciada para os genótipos de milho testados. A partir da caracterização morfológica foram realizados testes de Scott-Knott para agrupamento em relação ao tamanho dos conídios e crescimento micelial. Pelo comprimento do conídio foram obtidos quatro agrupamentos nos quais, os isolados de Palotina e Campo Largo estão distribuídos. Os isolados de Curitiba permaneceram no mesmo grupo. Pelo tamanho da colônia os agrupamentos foram diferentes aos 5°, 6° e 7° dias e houve uma distribuição heterogênea dos isolados. Características morfológicas foram utilizadas para compor uma matriz de dados e a árvore gerada agrupou os isolados de diferentes origens nos mesmos ramos, porém alguns com baixa sustentabilidade estatística. Foi realizado o sequenciamento das regiões ITS-5,8S-ITS2 do DNA ribossomal de 37 isolados. As sequências obtidas foram submetidas ao BLAST e analisadas pelos métodos de distância (Neighbor-Joining) e de Parcimônia. Pelo BLAST foi possível averiguar a identidade genética de todos os isolados de alotina com o Cochiobolus sp. Dezesseis isolados de Campo Largo apresentaram identidade genética acima de 90% com Cochiobolus lunatus, teleomorfo C.lunata, espécie patogênica ao homem e animais, e dois com o fitopatógeno Curvulariatrifolli, com menor identidade. Pela árvore de distância, os isolados de Palotina apresentaram menor variabilidade e ficaram distantes do grupo de Campo Largo que agrupou com uma sequência referência de Curvularia trifolli. Próximo a este grupo ainda ficaram C. gudauskasii e C. lunatus. Na árvore gerada pelo método de Parcimônia, a separação dos grupos de Campo Largo e de Palotina manteve-se. Outros ramos sofreram modificações. Foi possível verificar que por caracterização morfológica os grupos de Campo Largo e Palotina não se separaram enquanto pelos dados do sequenciamento pode-se afirmar com segurança que estes pertencem a diferentes espécies. Cinco isolados foram selecionados para um ensaio de antagonismo contra três espécies de fungos fitopatogênicos: Guignardia itricarpa, Fusarium sp. e Trichoderma sp. Todos os isolados testados apresentaram resultados significativos com as espécies ensaiadas, denotando o potencial uso no controle biológico de fitopatógenos deste fungo.

Abstract: Dematiaceous fungi cause helminthosporiosis or spots in several plant families and are very important to maize culture. Dematiaceous fungi from the genus Curvularia are frequently found in several plant substrates as saprophytic, phytopathogenic or endophytic, and can even be isolated from both soil and air. This present work aimed to assess the potential of healthy maize plaaqnts to serve as a depository of pathogenic fungal species, especially from the Curvularia genus, which is associated with several diseases in animals and plants. Fungi from different maize genotypes were isolated – 4 parental strains and 3 hybrids that descend from their cross, from the Campo Largo region, in Paraná (PR) state. Also, 22 Curvularia isolates from Palotina, PR, and 2 isolates from Curitiba, PR, were used. 23 Curvularia isolates were obtained from 3 parental genotypes - G4, G5 and G6, and G5 provided 52% of all isolates, and also from the 3 hybrids (G1, G2 and G3). No Curvularia was isolated from parental strain G7. From the hybrid G3 (G4 x G7), only one isolate was obtained. These results suggest a differentiated colonization for the tested maize genotypes. Scott-Knott tests were performed after a morphological characterization to group individuals regarding conidia size and mycelia growth was performed. By conidia length, four groups were formed in which isolates from Palotina and Campo Largo are distributed. All isolates from Curitiba remained in the same group. By colony size, grouping was different on the 5th, 6th and 7th days and there was a heterogeneous distribution of the isolates. Morphologic characteristics were used to put together a data matrix and the generated tree grouped isolates from different origins in the same branches, although some with low statistical sustainability. ITS- 5,8S-ITS2 regions of the ribosomal DNA from 37 isolates were sequenced. Obtained sequences were submitted to BLAST and analyzed by distance (Neighbor-Joining) and parsimony methods. It was possible to assess the genetic identity of all isolates from Palotina to Cochliobolus sp, using BLAST. Sixteen isolates from Campo Largo presented more than 90% of their genetic identity with Cochliobolus lunatus, teleomorph C. lunata, a species pathogenic to men and animals, and 2 isolates with the phytopathogenic Curvularia trifolli, with a lower identity. By the distance tree, isolates from Palotina presented lesser variability and were distant from the Campo Largo group which grouped with a reference equence from Curvularia trifolli. Near this group were C. gudauskasii and C. lunatus. On the tree generated by the parsimony method, the Campo Largo and Palotina groups were kept separated. Other branches underwent modifications. It was possible to verify that by morphologic characterization the groups of Campo Largo and Palotina were not separated while using sequencing data, and it's possible to assure that they belong to different species. Five isolates were selected to undergo an antagonism assay against three species of phytopathogenic fungi: Guignardia citricarpa, Fusarium sp. and Trichoderma sp. All tested isolates showed significant results with the species assayed, denoting their potential use on the biological control of phytopathogens of this fungus.