Desenvolvimento de bioprocesso para produção de biomassa rica em cobre e zinco por fermentação submersa utilizando leveduras isoladas do Baru (Dipteryx Alata Vog.) e testados em resíduos da agroindústria brasileira

Abstract

Resumo

Resumo: O objetivo principal do presente trabalho foi a produção de biomassa rica em zinco ou cobre para suplementação em ração animal por fermentação submersa utilizando subprodutos agrícolas produzidos no Estado do Paraná. Os frutos maduros de baru (Dipteryx alata) foram coletados de várias localidades de Campo Grande, Mato Grosso do Sul. Em seguida, foi determinada a composição centesimal da polpa. Da polpa, foram isoladas 11 cepas de leveduras, as quais foram identificadas com o auxílio do sistema comercial API20C AUX® e também por técnicas de biologia molecular (seqüenciamento) da melhor linhagem acumuladora de zinco e cobre. Para todos os experimentos foi realizado o preparo de inóculo em frasco de Erlenmeyer de 250 mL (volume de 100 mL), incubado sob agitação a 120 rpm, 30 °C durante 24 horas, ou até obter-se uma concentração de células da ordem de 1 x 107 a 1 x 108 células/mL. Foram testadas neste experimento, 11 leveduras isoladas do fruto baru e a cepa Pichia guilliermondii NRRLY27063 como referência. As condições utilizadas foram: melaço de soja e de cana a 5 °Brix; extrato de levedura, 10 g/L; (NH4)2SO4, 5 g/L; KH2PO4, 5 g/L; MgSO4, 0,5 g/L. A quantidade de inóculo utilizada foi de 10 % referente ao volume total (100 mL). As condições físicas utilizadas foram: temperatura, 30 °C; pH inicial, 6,0; agitação, 120 rpm; 120 horas. Dentre as 11 cepas isoladas, uma delas (BARU05, identificada pelo kit Api como Candida lusitaniae ou 100 % de identificação molecular, para Candida pelliculosa) apresentou melhores resultados. A otimização dos fatores físicos (pH, temperatura e taxa de inóculo) foi realizada como suporte de planejamentos experimentais do tipo fatorial 23, usando como substrato melaço de cana a 5º Brix enriquecido com 0,1 g/L CuSO4.5H2O ou ZnSO4.7H2O. Os experimentos foram realizados em frascos de Erlenmeyer 250 mL, em shaker a 120 rpm por 72 horas. A interpretação dos resultados obtidos foi realizada com o auxílio do STATISTICA7. Para o estudo da influência dos fatores químicos sobre o processo de produção de biomassa (g/L) e rendimento (%) do bioacúmulo dos microelementos, um planejamento experimental do tipo fatorial incompleto de 27-4 com 3 pontos centrais foi empregado para a seleção das variáveis. Na segunda etapa de otimização utilizou-se um planejamento experimental fatorial incompleto 24-1 para mais uma seleção de variáveis significativas. Uma terceira etapa de otimização foi realizada com o suporte de um planejamento do tipo DCCR. Os parâmetros físicos otimizados para o processo de bioacúmulo de cobre foram: pH 6, taxa de inóculo de 7,5 %, 30 ºC. Para o zinco: pH 4, taxa de inóculo de 5 %, 28 ºC. Após as etapas de otimização obteve-se para o zinco, um rendimento de 90,10 % e 12,046 g/L de biomassa. Para o cobre, o rendimento foi de 95,04 % e obtendo-se 13,397 g/L de biomassa. O processo de produção foi então conduzido em biorreator de 10 litros BioFlo® 110 (duplicata). O meio empregado na fermentação foi o melaço de cana a 10 ºBrix (sólidos solúveis). A agitação variou de acordo com o oxigênio dissolvido (DO2) que era de 30 %. O melaço de cana foi suplementado para o aumento do bioacúmulo e biomassa com 3 g/L de (NH2)2CO e 0,1 g/L de Fe2 (SO4)3 para o zinco, e com 2 g/L de (NH4)2SO4 e 3 g/L de (NH4)2HPO4 para o cobre. Foi obtido para a fermentação de zinco 90,53% de rendimento e 36,33 g/L de biomassa em 24 horas de fermentação. Para o cobre, foi obtido 91,98% de rendimento e 38,85 g/L de biomassa após 60 horas de fermentação. Para a fermentação em batelada alimentada de zinco obteve-se 58.43 g/L de biomassa a qual acumulou 22,73 mg/L (100 %) de zinco. O teste de cobre para a batelada-alimentada 57,54 g/L de biomassa e 100% de rendimento para o bioacúmulo. F i feita a análise de proteínas para biomassa seca obtida tanto para o processo do zinco quanto para o do cobre obtendo-se 49 % de proteínas. O processo demonstrou-se viável e promissor. Os produtos obtidos serão testados em ração animal.

Abstract: The main objective of this present work was the production of biomass rich in zinc or copper for supplementation in animal feed by submerse fermentation using agricultural by-products produced in State of Paraná. Mature fruits of Baru (Dipteryx alata) were collected from various locations of Campo Grande, Mato Grosso do Sul. In sequence, the centesimal composition of pulp was determined. From pulp, 11 yeast strains were isolated. All strains were identified with assistance of commercial system API20C AUX®, and also a molecular biology analysis (sequencing) of the best zinc and copper accumulator strain was realized. For all experiments, prepare of inoculum was realized in Erlenmeyer flasks of 250 ml (100 mL of media), incubated at agitation in Shaker-type incubator at 30 °C and 120 rpm during 24 hours, or until obtain a cell concentration of 1 x 107 to 1 x 108 cells/mL. In this experiment, 11 yeast strains isolated from Baru fruit and Pichia guilliermondii NRRLY27063 strain (as reference) were tested. The conditions were: sugarcane and soy molasses at 5 °Brix; yeast extract, 10 g/L; (NH4)2SO4, 5 g/L; KH2PO4, 5 g/L; MgSO4, 0.5 g/L. Inoculum rate was 10 % of total volume (100 ml). Physical conditions for all experiments were: temperature, 30 °C; initial pH, 6.0; agitation, 120 rpm; cultivation time, 120 hours. Between 11 strains isolated, one of them (BARU 05, identified as Candida lusitaniae by commercial system API20C AUX® and as Candida pelliculosa with 100 % of confirmation, according with molecular identification) demonstrated better results. Optimization of physical factors (pH, temperature and inoculum rate) was realized with support of 23 factorial experimental designs, using as substrate sugarcane molasses at 5 °Brix enriched with 0.1 g/L CuSO4.5H2O or ZnSO4.7H2O. Experiments were realized in Erlenmeyer flasks of 250 mL with cotton cover, in Shaker at 120 rpm for 72 hours. Interpretation of results obtained was realized with assistance of STATISTICA7 program. For study of influence of chemical factors on both biomass production process (g/L) and microelement bioaccumulation uptake (%), a 27-4 incomplete factorial experimental design with 3 center points was employed for selection of variables. 7 components in 2 different levels of concentration (g/L) and center points. On second step of optimization, an experimental design 24-1 was used, for another selection of significant variables. A third step of optimization was realized with support of a DCCR design. The physical conditions optimized for copper bioaccumulation process were: pH 6, 7.5 % of inoculum rate, 30 °C. For zinc: pH 4, inoculum rate: 5 %, 28 °C. After the steps of optimization, were obtained 90.10% of zinc uptake and 12.046 g/L of biomass for zinc process. For copper process, were obtained 95.04% of uptake and 13.397 g/L of biomass. The process of production was then conducted on 10 liters BioFlo® 110 bioreactor (duplicate). The media employed in fermentation was sugarcane molasses at 10 °Brix. Agitation varied according with dissolved oxygen (DO2) that was 30%. Sugarcane molasses was supplemented for increase in bioaccumulation and biomass production with 3 g/L of (NH2)2CO and 0.1 g/L of Fe2 (SO4)3 for zinc, and with 2 g/L of (NH4)2SO4 and 3 g/L of (NH4)2HPO4 for copper.For zinc fermentation were btained 90.53% of zinc uptake and 36.33 g/L of biomass production after 24 hours of fermentation. For copper, were obtained 91.98% of copper uptake and 38.85 g/L of biomass after 60 hours of process. For zinc fed-batch fermentation was obtained 58.43 g/L of biomass and bioaccumulation of 22.73 mg/L (100 %) of zinc. For copper, were obtained 57.54 g/L of biomass and 100 % uptake for bioaccumulation. Analysis of proteins content of dry biomass was realized for both zinc and copper process, obtaining 49 % of proteins. The process demonstrated to be viable and promising. The obtained product will be tested on animal feed.