Estudo da atividade hemolítica do veneno de Loxosceles intermedia (Aranha Marrom) e seus mecanismos moleculares

Abstract

As aranhas marrons estão distribuídas mundialmente e os acidentes relacionados são considerados um problema de saúde pública, especialmente na América do Sul, os quais são denominados como Loxoscelismo. Após os acidentes, as vítimas apresentam lesões cutâneas necróticas ao redor da picada e, em menor freqüência, sinais sistêmicos tais como insuficiência renal, coagulação intravascular disseminada e hemólise. Neste presente trabalho, nós estudamos o mecanismo molecular pelo qual uma toxina recombinante purificada e obtida da glândula do veneno, a qual é caracterizada bioquimicamente como uma fosfolipase-D, induz hemólise. O tratamento de eritrócitos provenientes de sangue humano com a toxina induziu experimentalmente hemólise direta de modo concentração- e tempo-dependentes. Os eritrócitos expostos à toxina fosfolipase-D recombinante apresentaram alterações morfológicas no tamanho e na forma das células de modo tempo-dependente. Além disso, a hemólise não foi dependente do grupo ABO e sistema Rh, uma vez que os eritrócitos humanos de diferentes grupos sanguíneos tratados com a toxina recombinante sofreram hemólise de uma maneira semelhante. A lise direta dos eritrócitos induzida pela fosfolipase-D recombinante depende da espécie do animal testado, já que eritrócitos obtidos a partir de humanos, de coelhos e de carneiros sofreram hemólise em uma porcentagem muito superior do que a observada com eritrócitos de cavalo. Em ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência indireta, bem como na citometria de fluxo, seja utilizando anticorpos contra a fosfolipase-D, ou uma proteína fusão recombinante GFP-fosfolipase-D mostraram a ligação direta da toxina à membrana dos eritrócitos humanos. Além disso, eritrócitos incubados com a toxina recombinante reagiram com anexina-V e tiveram alteração do seu perfil de distribuição dos microdomínios lipídicos, corroborando com uma mudança no conteúdo de fosfolipídios da membrana tratada, que passou a expor na superfície celular um fosfolipídio carregado negativamente, a fosfatidilserina, mostrando também uma reorganização dos componentes da membrana lipídica. Adicionalmente, três quelantes de íons divalentes (EGTA, EDTA e 1,10-fenantrolina) inibiram significativamente a hemólise induzida pela fosfolipase-D (a qual contém magnésio, no domínio catalítico), em comparação ao PMSF, um inibidor de serino-protease, que não teve efeito sobre hemólise, sugerindo que a catálise está envolvida na hemólise. Finalmente, usando uma fosfolipase-D recombinante com mutação sítio-dirigida no domínio catalítico, na qual foi substituída a histidina da posição 12 por uma alanina, a hemólise e as alterações morfológicas dos eritrócitos foram completamente inibidas. No entanto, a toxina mutada não perdeu a capacidade de ligar-se à superfície dos eritrócitos, o que reforça a idéia do envolvimento da atividade catalítica da enzima no efeito hemolítico e nas alterações celulares, mas não apenas vinculada à ligação da toxina na superfície celular. Desse modo, os resultados aqui descritos fornecem evidências de que a fosfolipase-D do veneno de L. intermedia desencadeia a hemólise direta sobre de eritrócitos humanos de maneira dependente da atividade catalítica.

Brown spiders have world-wide distribution and accidents that are considered health problem especially in South America are named loxoscelism. Victims followed accidents present necrotic cutaneous lesions surrounding the bites and in a less intensity systemic signs such as renal failure, disseminated intravascular coagulation, and hemolysis. Here, we studied the molecular way by which a purified recombinant toxin from the venom gland, biochemically characterized as phospholipase-D, causes hemolysis. Toxin treatment of human blood erythrocytes experimentally induced direct hemolysis in a dose-dependent concentration manner and in a time-dependent way. Erythrocytes exposed to the recombinant phospholipase-D toxin showed morphological changes in size and shape of cells in a timedependent manner. Also, hemolysis was not dependent of ABO group and Rhesus systems, since human erythrocytes from all blood group treated by recombinant toxin suffered hemolysis in a similar manner. The direct lysis of erythrocytes evoked by recombinant phospholipase-D depends on animal species tested, since erythrocytes from human, rabbit and sheep suffered hemolysis in higher percentage than horse erythrocytes. Confocal microscopy and immunofluorescence assay using antibodies against phospholipase-D, as well as cell cytometry and confocal microscopy using a recombinant fusion GFP-phospholipase-D protein supported the direct binding of toxin to membrane of human erythrocytes. Moreover, erythrocytes treated by recombinant toxin reacted with annexin-V and had their lipid rafts profile altered, supporting for a changing in the phospholipid membrane contend of treated cells exposing negatively charged phosphatidylserine at the cell surface, and for a reorganization of membrane lipid components. Additionally, three divalent ion chelators (EGTA, EDTA and 1,10-phenanthroline), significantly inhibited hemolysis evoked by phospholipase-D (that has magnesium at the catalytic domain), as compared to PMSF a serine-protease inhibitor that had no effect upon hemolysis, suggesting catalysis as involved upon hemolysis. Finally, by using a site directed mutated recombinant phospholipase-D at the catalytic domain, substituting histidine at position 12 by alanine, the hemolysis and morphologic changes of erythrocytes were completely inhibited, but not the toxin binding on the erythrocytes surface, supporting that the catalytic activity of enzyme is involved on hemolysis and cellular alterations but not on the toxin cell binding. Thus, results described herein provide evidence that phospholipase-D from L. intermedia venom stimulates direct hemolysis upon human blood cells in a catalytic-dependent way.