Padronização de ensaio imunoenzimático para detecção de imunoglobulinas G e E ovinas anti-Haemonchus contortus, seu uso na seleção de animais resistentes a verminose gastrointestinal e na compreensão dos fenomenos imunológicos que decorrem da interação entre hospedeiro e parasito
Resumo
Resumo: Os objetivos deste trabalho foram padronizar a técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de anticorpos das classes IgG e IgE ovinas específicos contra Haemonchus contortus (H.c.) e validá-la como ferramenta no estudo da resposta imune dos ovinos aos helmintos gastrintestinais e na seleção de animais resistentes às parasitoses. Para isso, foi acompanhado um rebanho de 20 ovelhas e 25 cordeiros mestiços suffolk, na Região de Curitiba, Paraná, no período de julho de 1998 a junho de 1999, por meio de coletas mensais de sangue e fezes. Os animais estavam sujeitos à infecção natural por nematódeos durante todo o período do experimento. O marcador parasitológico utilizado foi o número de ovos de helmintos por grama de fezes (OPG); os marcadores imunológicos foram o número de eosinófilos sanguíneos, Imunoglobulina G (IgG) específica, Imunoglobulina E (IgE) total e específica. O hematócrito (HT) foi utilizado como indicativo de resiliência. Tanto para a pesquisa de IgG e quanto IgE específicas, a concentração ótima de antígeno H.c. por poço foi de 500ng e, para a detecção de IgG as diluições ótimas de soro e conjugado foram, respectivamente, 1:80 e 1:1000. As ovelhas apresentaram um padrão de resposta à verminose definido para cada animal, o que possibilitou que cada indivíduo fosse identificado como resistente ou susceptível pelo OPG. Ovelhas resistentes tiveram menores médias de OPG, maiores médias de HT e eosinófilos que as susceptíveis. O nível de anticorpos se mostrou variável entre os grupos, mas houve uma tendência do grupo susceptível em apresentar menores médias de IgE e maiores de IgG específica que o grupo resistente. Tanto o número de eosinófilos quanto a IgE específica poderiam ser utilizados concomitantemente com o OPG para a identificação de ovelhas resistentes e susceptíveis. O número de eosinófilos sanguíneos foi o único marcador imunológico capaz de classificar as ovelhas indiretamente nos mesmos grupos obtidos para o OPG. Também foi o único marcador imunológico a estar significativamente mais elevado nos indivíduos classificados como resilientes pelo HT. Os cordeiros mostraram uma estabilização no comportamento das variáveis imunológicas por volta dos seis meses e meio de idade, indicando um padrão de resposta imune aos helmintos gastrintestinais. Contudo, esta resposta não foi completa e, em alguns animais, variou conforme o pico de parasitismo. A identificação de cordeiros resistentes só foi possível com os dados de OPG de três picos de parasitose pós-desmame. Cordeiros resistentes tenderam a ter maiores médias de HT, eosinófilos circulantes, IgE total, IgE e IgG específicas que os susceptíveis, mas somente para IgE total e específica as diferenças foram significativas durante a maior parte do acompanhamento. Foi possível identificar indiretamente cordeiros de alto e baixo OPG pelos dados de IgE específica, medidos durante os três picos de parasitismo. Tanto para seleção direta pelo OPG quanto indireta pela IgE anti-H.c., foram necessários dados de três picos de parasitismo pósdesmame. Portanto, para todas as hipóteses, os cordeiros somente puderam ser selecionados quando tinham uma média de dez meses de idade. Cordeiros resilientes apresentaram maiores níveis séricos de IgE total e IgG específica, indicando diferentes mecanismos de resposta ao antígeno parasitário que os animais resistentes. Abstract: This work was conducted in order to standardize an enzyme-linked-immunosorbent assay (ELISA) to detect ovine immunoglobulinG andE anti-Hoemorichus contortus (H.c.) to study the immune response of sheep subjected to natural challenge of gastrointestinal parasites and to verify the possibility of identifying animals that are resistant to parasites through parasitological and immunological markers. Twenty ewes and25lambs froma farm in Curitiba, Parana, Brazil, were sampled monthly for blood and faeces, from July of 1998 to June of 1999. Sheep were under natural infection of gastrointestinal nematodes thewholetime ofthe experiment. Faecal egg count (FEC) was chosen as parasitological marker. The number of peripheral eosinophils, total and specific IgE and specific IgG antibodies were used as immunological markers. The packed-cell value (PCV) was used asa resilience indicator. For the specific antibody assays, the optimum concentration of antigen per well was 500 ng. For IgG anti-H.c. detection, serum samples and conjugate were diluted 1to 80 and 1 to 1000, respectively. Each ewe hada pattern of response to helminths during the whole experimental period. This allowed each animal to be classified as resistant or susceptible by FEC. Resistant ewes hadlower FEC and higher number ofperipheral eosinophils than susceptible ewes. Antibody levels were very variable in both groups, but there wasa tendency ofsusceptible sheep tohave lower IgEand higher IgG than resistant ones. Both peripheral eosinophils and specific IgE data could be joined to FEC in order to identify resistant or susceptible animals. The numberofperipheral eosinophils was the only immunological makerthat was able to classify high and low FEC ewes in two different groups. It was also the only immunological variable to be higher in resilient ewes. The lambs showed stabilisation in the level of immunological markers when they had reached 28 weeks ofage. But this was nota definitive and complete response. Someoftheanimals showeda slight variation from one challenge to another. The identification of resistant or susceptible lambs was possible when data of three peaks of FEC post-weaning were analysed. There was a tendency for resistant lambs to show higher means forperipheral eosinophils, specific IgG, total and specific IgE, but onlyfortotal and specific IgE were the differences significant. It was possible to identify indirectly high and low FEC lambs using specific IgE of three peaks ofFEC. Selection of lambs based both in FEC or in specific IgE required data from three peaks of parasitism post-weaning. Thus, lambs could be selected only when they had reached 10 months ofage. Resilient lambs had higer total IgE and specific than the susceptible ones. This might indicate pattern of immuneresponse different from theresistant lambstoparasite antigens.
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