Desenvolvimento de bioprocesso para produção de xilanases por fermentação no estado sólido utilizando bagaço de cana-de-açúcar e farelo de soja

Abstract

Resumo: Foram realizadas fermentações no estado sólido (FES) utilizando bagaço de cana de açúcar, o qual foi suplementado com farelo de soja, com o objetivo de produção de xilanases, procurando-se inicialmente isolar e selecionar uma cepa fúngica promissora. A partir de um total de 20 cepas, sete foram selecionadas qualitativamente em placas com xilana como única fonte de carbono, onde o corante vermelho do congo revelou os maiores halos de produção de xilanase. Para o teste quantitativo foi selecionado um meio de produção comum a todos os microrganismos. Duas cepas de Aspergillus niger obtiveram a melhor produção, e foram submetidas a uma cinética de produção por 10 dias onde foram obtidos alguns parâmetros fermentativos, selecionando-se finalmente a Aspergillus nigerLPB 326. O substrato foi analisado físico-quimicamente, estudando-se também as proporções ideais de bagaço de cana e farelo de soja a serem utilizadas, além da capacidade de absorção de água. A produção que melhor induziu a produção da enzima foi de 65/35% para bagaço de cana e farelo de soja, respectivamente, com capacidade máxima de absorção de água de 85% nesta proporção. A partir destes dados iniciou-se a otimização dos seguintes parâmetros fermentativos: pH, umidade, temperatura, solução mineral, concentração dos sais da solução mineral, e extração da enzima. Todas essas variáveis foram estudadas estatisticamente através da metodologia de superfície de resposta. O ajuste de pH inicial mostrou-se não significativo, visto que em outros estudos o pH natural do meio, juntamente com a solução mineral, foi considerado ideal para a produção da enzima de interesse. A umidade ótima ficou em 85% e a temperatura em torno de 30oC. Os sais e as concentrações otimizadas foram: CuSO4, KH2PO4e CoSO4 em 0.4 g/l, 1.5 g/l e 0.0012 g/l, respectivamente. Em relação à extração da enzima, as melhores condições foram: 37 mL de solução de extração em 3 g de fermentado, agitação à 33 rpm por 5 minutos, com posterior centrifugação do extrato enzimático à 3500 rpm por 10 minutos. Após a otimização a maior atividade de xilanase obtida foi de 3.099 UI/gms. O efeito de alguns aditivos no meio fermentativo foram estudados, e somente o tratamento com Tween 80 exerceu efeito positivo sobre a produção de xilanase, aumentando em 6% a atividade enzimática em relação ao padrão. Em um primeiro estudo de secagem, o material fermentado seco na temperatura de 42oC por 20 horas foi o mais satisfatório. Em um segundo estudo de secagem, o tratamento com cloreto de cálcio, exerceu um efeito positivo na temperatura de 50oC para as duas cepas estudadas, A. niger LPB 3 e A. niger LPB 326; no entanto, um efeito contrário foi observado para a temperatura de 75-80oC, onde a presença de cloreto de cálcio praticamente não interferiu na atividade da xilanase. O extrato bruto enzimático foi caracterizado, em relação à temperatura e pH ótimos para atividade da xilanase produzida, e alguns estudos de estabilidade do produto líquido e após a secagem do material fermentado foram conduzidos em diferentes temperaturas. As atividades enzimáticas à 50oC mostraram ser maiores para todos os pH estudados (exceto pH 8,0), com pH ótimo na faixa de pH de 5,3 a 5,8. A xilanase estudada mostrou ser mais estável à 50oC com grandes perdas de atividade à 60oC; no entanto, a presença de xilana apresentou um efeito positivo aumentado a meia-vida da enzima. O Mg+2 modulou positivamente a atividade enzimática da xilanase. As constantes Km e Vm·x foram 3,79 mg-1mL-1 e 5,97 µmol-1min-1mg, respectivamente. O congelamento da enzima com xilana extraída manteve 75% de atividade de xilanase após cinco dias. O tratamento com manitol 3% e leite em pó desnatado 1% foram úteis na manutenção da atividade enzimática durante a liofilização. As caracterÌsticas do extrato bruto enzimático contendo xilanase produzido neste trabalho o tornam viável para aplicações que não exijam pureza (devido à presença de outras enzimas, como a celulase) e que possam ser realizadas de acordo com os resultados obtidos nos estudos de estabilidade.