dc.contributor.advisor | Veiga, Silvio Sanches, 1962- | pt_BR |
dc.contributor.author | Kusma, Josiana | pt_BR |
dc.contributor.other | Gremski, Waldemiro, 1945- | pt_BR |
dc.contributor.other | Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular | pt_BR |
dc.date.accessioned | 2018-04-20T20:11:20Z | |
dc.date.available | 2018-04-20T20:11:20Z | |
dc.date.issued | 2008 | pt_BR |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/1884/15100 | |
dc.description | Orientador : Silvio Sanches Veiga | pt_BR |
dc.description | Co-orientador : Waldemiro Gremski | pt_BR |
dc.description | Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2008 | pt_BR |
dc.description | Inclui bibliografia e anexos | pt_BR |
dc.description | Área de concentraçao : Biologia celular e molecular | pt_BR |
dc.description.abstract | Acidentes provocados pela picada de aranhas marrons (Gênero Loxosceles)
estão relacionados com manifestações clínicas, incluindo dermonecrose com
espalhamento gravitacional e envolvimento sistêmico que pode incluir insuficiência
renal, trombocitopenia e hemólise. No presente trabalho, usando camundongos
expostos a um tipo selvagem de fosfolipase – D recombinante (toxina
dermonecrótica) e uma isoforma dessa toxina mutada no sítio catalítico, fomos
capazes de mostrar que o mecanismo pelo qual o veneno provoca danos renais é
dependente da atividade catalítica da enzima. Análises por microscopia óptica de
biópsia renal de camundongos tratados com a toxina selvagem dermonecrótica
recombinante "LiRecDT1" mostraram alterações morfológicas incluindo edema
glomerular, eritrócitos e colapso do Espaço de Bowman, deposição de material
protéico dentro do lúmen tubular e edema tubular, mas ausência de nefrotoxicidade
para camundongos tratados com a isoforma da toxina mutada. Análises
ultraestruturais por microscopia eletrônica de transmissão confirmam a
citotoxicidade da toxina selvagem apontando distúrbios na estrutura glomerular
em podócitos e no endotélio fenestrado. Alterações nos túbulos incluem deposição
de material amorfo, edema do lúmen e um grande acúmulo de corpos
multivesiculares bem como de estruturas elétron-densas no interior das células
epiteliais. Adicionalmente, análises bioquímicas da urina e do sangue mostraram
que a toxina selvagem induziu alterações na função renal como, hematúria e
azotemia com elevação de uréia no sangue. Além disso, animais tratados com a
fosfolipase – D selvagem tiveram proteinúria evidente, já a toxina mutada causou
apenas atividade residual. Diferenças biológicas entre as toxinas recombinantes
foram corroboradas através de ensaios de letalidade, que mostraram oligúria e
mortalidade dos animais tratados com a toxina selvagem, porém ausência nos
animais expostos à toxina mutada. Imunofluorescência com anticorpos que
reconhecem a toxina fosfolipase–D foi analisada por microscopia confocal
revelando deposição, tanto da toxina do tipo selvagem quanto a mutada, ao longo
das estruturas tubulares renais. Por imunoblot utilizando soro hiperimune que
reconhece a fosfolipase - D do veneno sobre urina de ratos tratados com as
toxinas, nós detectamos sinal positivo na região de 30kDa de animais tratados com
toxina do tipo selvagem, mas nenhuma reação positiva na urina de camundongos
expostos à toxina mutada. Do mesmo modo, a toxina do tipo selvagem causou
alterações morfológicas em células MDCK (epiteliais tubulares), incluindo
aparecimento de vacúolos citoplasmáticos, defeito na adesão célula-célula e com o
substrato de cultura. Também, tratamento com a toxina selvagem inibiu a
viabilidade das células MDCK avaliadas pelo ensaio de captação do corante vital
vermelho neutro, enquanto a isoforma mutada não apresentou nenhuma atividade.
Assim, com base nos dados atuais, temos definida pela primeira vez na literatura
um mecanismo molecular para a nefrotoxicidade causada pelo veneno de
Loxosceles intermedia dependente da atividade catalítica da toxina fosfolipase – D. | pt_BR |
dc.description.abstract | Accidents evoked by the bites of brown spiders (Loxosceles genus) are
related to clinical manifestations including skin necrosis with gravitational spreading
and systemic involvement that may include renal failure, hemolysis and
thrombocytopenia. In the present report, by using mice exposed to recombinant
wild-type phospholipase-D (dermonecrotic toxin) and a mutated toxin isoform at the
catalytic domain, we were able to show that the mechanism by which the venom
induces renal damage is dependent on the catalytic activity of the enzyme. Light
microscopy analysis of renal biopsies from recombinant wild-type phospholipasetreated
mice showed morphologic alterations including glomerular edema,
erythrocytes and collapse of Bowman’s space, deposition of proteinaceus material
within the tubular lumen and tubular edema, but absence of nephrotoxicity for
mutated toxin-treated animals. Ultrastructural analysis through transmission
electron microscopy confirmed wild-type toxin cytotoxicity pointing disorders of
glomerular filter structure at foot processes and fenestrated endothelium
membrane. Tubule alterations include deposits of amorphous material and edema
of tubular lumina and increase in epithelial cytoplasmic multivesicular bodies and
electron dense structures. Additionally, biochemical analyses of urine and blood
showed that wild-type toxin induced changes in renal function causing hematuria
and azotemia with elevation of blood urea. Moreover, wild-type phospholipase-D
treatment induced proteinuria, whereas mutated toxin caused only residual activity.
Biological differences for recombinant toxins were corroborated through mice
lethality experiments, which showed oliguria and animal mortality after wild-type
treatments, but an absence of lethality following mutated toxin exposure.
Immunofluorescence with antibodies to phospholipase-D toxin and confocal
microscopy analysis showed deposition of both wild-type and mutated toxins along
the renal tubular structures. Immunoblotting with a hyperimmune antiserum against
venom phospholipase on urine from toxins-treated mice, we detected a positive
signal at region of 30kDa to animals treated with wild-type toxin, but no reaction on
urine of mice exposed to mutated toxin. Similarly, wild-type toxin treatment caused
morphological alterations of MDCK cells including appearance of cytoplasmic
vacuoles, evoked impaired spreading cells detached from each other and from the
culture substratum. Wild-type phospholipase toxin treatment of MDCK cells
changed their viability evaluated by Neutral-Red Uptake, while mutated isoform had
no activity. Thus, on the basis of the present data, we have defined for the first time
at literature a molecular mechanism for Loxosceles venom nephrotoxicity
dependent on the catalytic activity of phospholipase-D toxin. | pt_BR |
dc.format.extent | x, 104f. : il. algumas color. | pt_BR |
dc.format.mimetype | application/pdf | pt_BR |
dc.language | Português | pt_BR |
dc.language | poreng | pt_BR |
dc.relation | Disponível em formato digital | pt_BR |
dc.subject | Teses | pt_BR |
dc.subject | Aranha - Veneno | pt_BR |
dc.subject | Citologia e biologia celular | pt_BR |
dc.subject | Biologia molecular | pt_BR |
dc.title | Estudos da atividade nefrotóxica da toxina dermonecrótica (fosfolipase-D) do veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia | pt_BR |
dc.type | Dissertação | pt_BR |