QSOX recombinante de mamífero : produção, purificação e atividade enzimática

Abstract

Sulfidril oxidases são enzimas que catalisam a formação de dissulfetos em peptídeos e proteínas com a redução do oxigênio molecular para peróxido de hidrogênio. Duas famílias de sulfidril oxidases dependentes de FAD foram descritas até agora: a família QSOX (quiescina sulfidril oxidase) e a família ERV/ALR (essential for respiration and vegetative growth/augmenter of liver regeneration). Os membros da família QSOX compartilham seqüências semelhantes e seqüências de aminoácidos características. Estas enzimas possuem um domínio N-terminal tiorredoxina-PDI (proteína dissulfeto isomerase) e um domínio C-terminal ERV com o sitio de ligação de FAD. A família QSOX inclui a quiescina humana de fibroblasto de pulmão e as sulfidril oxidases de clara de ovo de galinha, vesícula seminal de rato, células endometriais de porcos da índia e epiderme de rato. As QSOX parecem ser essenciais em algumas funções celulares como no dobramento de proteínas, elaboração da matriz extracelular, regulação do estado redox e no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo expressar a QSOX de mamífero de células musculares lisas humanas e cerebelo de camundongo em sistema recombinante heterólogo de E. coli, purificar a proteína produzida por IMAC (cromatografia de afinidade a metal imobilizado) e analisar sua atividade enzimática usando como substratos DTT, GSH e cisteína. Os resultados mostram que apenas a QSOX de camundongo foi produzida com atividade e que diferentes valores de pH da reação, alteram sua funcionalidade. Concluindo, a enzima QSOX recombinante produzida em nosso laboratório dará suporte para próximos experimentos, na tentativa de encontrar possíveis funções para a enzima.

Sulfhydril oxidases are enzymes that catalyze the formation of disulfide bonds in peptides and proteins with the reduction of molecular oxygen to hydrogen peroxide. Two families of FAD-linked sulphydril oxidases have been described so far: the QSOX (quiescin sulphydril oxidase) family and the ERV/ALR (essential for respiration and vegetative growth/augmenter of liver regeneration) family. QSOX members share strong cDNA sequence identities and common amino-acidic sequence features. They display an N-terminal thioredoxin PDI (protein disulphide isomerase)-like domain and a C-terminal ERV1-like domain, which contains the FAD-binding site. The QSOX family includes the human quiescin Q6 from lung fibroblasts and sulphydril oxidases from chicken egg White, rat seminal vesicles, guinea-pig endometrial cells and mouse epidermis. Quiescin/sulphydril oxidase (QSOX) proteins have been implicated in essential cellular functions such as protein folding, elaboration of the extracellular matrix, regulation of the redox state and control of the cell cycle. The aim of this work was to express mammalian QSOX from human smooth muscle cells and mouse cerebellum in E. coli recombinant system, purify the protein by IMAC (immobilized metal affinity chromatography) and analyze its enzymatic activity using some substrates like DTT, GSH and cysteine. Results show that only mouse QSOX was produced in an active form and that different pH values alters its activity. In conclusion, the recombinant QSOX produced in our laboratory will give support for next experiments trying to find out possible functions to the enzyme.