Caracterização morfoestrutural e molecular do processo de amastigogenese extracelular em Trypanossoma cruzi

Abstract

O Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, que continua sendo um importante problema de saúde pública na América Latina. Os estudos sobre o T. cruzi têm sido facilitados pela possibilidade de cultivo e diferenciação in vitro dos principais estágios evolutivos do parasita. Este trabalho aborda o estudo de aspectos morfológicos e moleculares da diferenciação in vitro de tripomastigotas metacíclicos para amastigotas (amastigogênese extracelular). Extensas mudanças morfológicas foram caracterizadas por microscopia óptica e eletrônica durante a diferenciação, como brotamento, crescimento e liberação de uma estrutura muito semelhante à forma amastigota, com capacidade replicativa e positiva para a marcação com o anticorpo alfa-Ssp-4 específico para amastigotas. Análises por espectrometria de massas mostraram que o perfil lipídico total é alterado, com aumento na proporção de liso-lipídios durante a diferenciação, podendo estar correlacionado às alterações morfológicas observadas no processo de amastigogênese. Com o intuito de obter amostras enriquecidas de membrana plasmática, foi elaborada uma nova estratégia, baseada na interação biotina/avidina. Tal estratégia visou o estudo mais detalhado dos constituintes da membrana, visto que foi observada alteração em sua forma, sugerindo sua relevância para o processo de diferenciação. Foram também feitas análises do transcritoma de amastigotas extracelulares utilizando microarranjos de DNA, comparando-os com os demais estágios, principalmente tripomastigotas metacíclicos e amastigotas obtidos de cultura de células. Estas análises proporcionaram uma visão geral dos grupos de genes diferencialmente expressos entre tripomastigotas metacíclicos e amastigotas extracelulares, no qual se pode destacar como aumentados em amastigotas genes envolvidos na replicação, reparo e transcrição do DNA, e no processamento de RNA. Também foram detectados genes com o mesmo padrão de expressão em amastigotas extracelulares e amastigotas de cultura de célula, sugerindo a proximidade entre os dois tipos de formas replicativas intracelulares. Tais grupos gênicos podem ser agora melhor investigados, corroborando para a elucidação dos mecanismos de regulação de sua expressão, suas funções em cada estágio e sua importância durante a diferenciação. Os dados aqui apresentados abrem muitas perspectivas para a investigação da amastigogênese, um fenômeno ainda pouco conhecido, de vital importância para o T. cruzi e que pode conter novas informações para o desenvolvimento de terapias para doença de Chagas.

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas’ disease, which still represents an important public health problem in Latin America. Studies on T. cruzi have been rendered feasible by the possibility to reproduce under in vitro culture conditions the life-cycle of the parasite. This work is focused on the description of the morphological and molecular changes occurring in the course of the in vitro differentiation of metacyclic trypomastigotes to amastigotes (extracellular amastigogenesis). The morphological changes have been characterized by optical and electron microscopy investigation during differentiation, including budding, development and release of a structure resembling to amastigote forms. These extracellular amastigotes are able to replicate and react with an antibody against the Ssp-4 antigen, which is specific for amastigotes. Mass-spectrometry analyses have shown total lipid profile changes during amastigogenesis, with an increase in lyso-lipids ratios during differentiation; this could be related to morphological alterations observed in the course of the amastigogenesis process. In order to obtain plasma membrane enriched samples, a new strategy was elaborated based on biotin/avidin affinity purification. The strategy aims to identify plasma membrane and its components, since important morphological changes occur during amastigogenesis which are very likely relevant to differentiation process. Furthermore, the transcriptome analysis of extracellular amastigotes is described using DNA microarrays to compare metacyclic trypomastigotes and cell culture derived amastigotes. These analyses allowed a broad comparison between metacyclic trypomastigotes and extracellular amastigotes differentially expressed group of genes, such as those involved in replication, repairing and transcription of DNA, and processing of RNA, almost all of them more expressed in extracellular amastigotes. Genes presenting similar expression patterns have been also observed in extracellular and intracellular amastigotes, suggesting the similarity between these developmental forms. These genes are being investigated in order to get further insight into the mechanisms involved in their expression regulation and their relevance to the differentiation process. The data presented herewith pave the way to investigate the amastigogenesis process, an important step of T. cruzi life-cycle.