Expressão e purificação da proteína recombinante 6HIS-ADAM23 e caracterização da sua interação com a proteína prion celular

Abstract

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as células precursoras de neurônios migram para seus destinos finais e os axônios fazem conexões com alvos específicos a fim de estabelecer uma correta rede nervosa. Entre uma série de proteínas envolvidas neste fenômeno, moléculas de adesão possuem um papel central na interação célula-matriz e célula-célula. A Disintegrin And Metalloprotease (ADAMs) são proteínas transmembrânicas com atividade proteolítica e adesiva, sendo estas duas propriedades importantes no desenvolvimento do sistema nervoso. ADAM23 é um membro desta família, expressa principalmente no sistema nervoso central e atua na adesão, uma vez que, seu domínio metaloprotease é inativo. Animais deficientes para o gene adam23 desenvolvem problemas neurológicos tais como tremor e ataxia logo após o nascimento e sobrevivem no máximo duas semanas. Ambas as observações, sugerem a participação de ADAM23 no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel fisiológico desta proteína. Interessados nos possíveis papéis desempenhados por ADAM23 no sistema nervoso, decidimos investigar interações desta proteína com outras moléculas. Sabendo que PrPc é uma proteína de superfície altamente expressa no sistema nervoso central que pode atuar como molécula de adesão, resolvemos investigar a possível interação entre ADAM23 e PrPc. Para que essa interação fosse investigada, primeiramente, foi necessária a produção da proteína 6His-ADAM23 em sistema heterólogo de E. coli e sua utilização como antígeno na imunização de animais para a obtenção de anticorpos policlonais. Com auxílio destas ferramentas foi possível caracterizar a interação in vitro entre ADAM23 e PrPc. Os ensaios de co-imunoprecipitação e pull-down mostraram que ADAM23 interage in vitro com PrPc. As análises de imunofluorescência, usando neurônios hipocampais, células da linhagem SHSY-5Y e N2A, mostraram que estas duas proteínas co-localizam em regiões da superfície celular. Finalmente, demonstramos que ADAM23 recombinante promove a adesão de neuroblastomas e essa adesão é inibida quando PrPc da superfície celular é bloqueado por anticorpos anti-PrPc. Esses resultados sugerem um novo papel para PrPc na adesão celular mediada por ADAM23.

During the development of the nervous system, neurons migrate to final destinations and axons make connections with specific targets in order to establish a functional nervous net. Among the proteins involved with these phenomena, adhesion molecules have a main role in stimulating cell-matrix and cell-cell interactions. A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) transmembrane proteins have metalloprotease and adhesion activities, which are both important to the nervous system development. ADAM23 is an important member of this family predominantly expressed in the central nervous system (CNS) and can act in cell adhesion since it lacks metalloprotease activity. In addition, mice deficient in ADAM23 develop tremor and ataxia and die less than two weeks after birth. These observations suggest that ADAM23 plays a role in the development, maintenance and function of the CNS. However, the physiological role of ADAM23 is still unclear. Interested in ADAM23's roles, we decided to investigate the interactions between ADAM23 and other molecules. Since PrPc is a glycolipid-anchored protein expressed mainly in CNS, which can also act as an adhesion molecule, we decided to investigate the possible interaction between ADAM23 and PrPc. First, it was necessary to produce some tools specific for ADAM23. Recombinant ADAM23 6His tagged was obtained from heterologous system of E. coli. This purified protein was used to immunize animals to obtain polyclonal antibodies. With these new reagents, it was possible to characterize the in vitro interaction between ADAM23 and PrPc. Coimmunoprecipitation and pull down assays showed that ADAM23 can interact in vitro with PrPc. Sub-cellular co-localization of PrPc and ADAM23 was verified in fluorescence analysis of mouse hippocampal neurons, SHSY-5Y and N2A cells using mouse anti-PrPc and rabbit anti-ADAM23 antibodies. Finally, we demonstrated that the recombinant ADAM23 promotes adhesion of neuroblastoma cells and this adhesion is inhibited when PrPc is blocked by anti-PrPc antibody. Taken together, these findings propose a novel role for PrPc in ADAM23-mediated cell adhesion.