Aplicação de um novo modelo de epiderme humana reconstituída in vitro para avaliação de irritantes cutâneos

Abstract

Resumo: O desenvolvimento de metodologias alternativas tem se mostrado cada vez maisimportante para a aplicação do princípio dos 3 Rs (Replacement, Reduction andRefinement). Dentro desse contexto, a Epiderme Humana Reconstruída (RHE –Reconstructed Human Epidemis) é um modelo capaz de simular as característicasmorfológicas, bioquímicas e fisiológicas da epiderme humana, podendo ser utilizadopara diversos fins científicos, por exemplo, na avaliação da toxicidade desubstâncias químicas. Apesar de esse modelo ter elevada aceitação no contexto datoxicologia regulatória, ele é ainda pouco adotado em pesquisas acadêmicas,principalmente devido aos altos custos, dificuldades de aquisição e limitações deinformações acerca do protocolo de construção. Frente a isso, nosso objetivo foidesenvolver um novo modelo de RHE, aqui referido como Skinvitro-RHE, por meioda análise de fatores que potencialmente influenciam culturas de RHE (i.e..recobrimento dos insertos, placa de cultivo, densidade de poros dos insertos, meiode cultura, suplementos do meio de cultura, tempo de condição submersa, umidadee idade dos doadores de queratinócitos). A partir dessa análise, elaboramos umprotocolo aberto, a fim de aumentar a acessibilidade do modelo de RHE paralaboratórios acadêmicos e estudos que não se enquadram nas condições de BoasPráticas de Laboratório (BPL). Além disso, como segundo objetivo do trabalho,avaliamos a aplicabilidade desse modelo no teste de irritação dérmica in vitro,seguindo o método OECD TG 439. A melhor condição de construção da RHE foi ageração de um modelo construído com queratinócitos neonatais, plaqueados eminsertos de alta densidade de poros e revestidos com colágeno IV. Por meio desseprotocolo de construção, obtivemos uma RHE altamente similar à epiderme humanacom as quatro camadas de diferenciação e estrato córneo bem definido (~ 7camadas, 66,7 µm de espessura). Além disso, quando exposta a marcadores dediferenciação (Queratina-10, Queratina-14, Filagrina, Involucrina), apresentoupadrão de marcação semelhante à epiderme humana. Este modelo também seenquadrou nos parâmetros de controle de qualidade preconizados pela OECD TG439 e, assim, demonstrou boa viabilidade celular (densidade óptica média em 570nm de 1,7 ± 1,08) e função de barreira (IC50 de 2,77 ± 0,53 mg/mL - Dodecil Sulfatode Sódio). A Skinvitro-RHE foi, então, avaliada quanto ao seu potencial de uso paraavaliação de irritação dérmica por meio de 15 substâncias de referência (7 irritantese 8 não irritantes), usualmente empregadas em estudos de avaliação. Os resultadosmostraram que a Skinvitro-RHE foi capaz de discriminar substâncias irritantes denão irritantes, apresentando especificidade de 85,71 %, sensibilidade de 100 % eprecisão de 93,33 %. Em conclusão, esses resultados demonstram que a Skinvitro-RHE é um modelo promissor, acessível e altamente reprodutível, que pode serutilizado para teste de irritação dérmica, bem como outras finalidades científicas pormeio de seu protocolo aberto, contribuindo para a disseminação e implementação demétodos alternativos, principalmente em setores em que esse modelo 3D ainda nãoé bem difundido.

Abstract: The development of alternative methodologies has been shown to be increasinglyimportant for the application of the principle of 3 Rs (Replacement, Reduction andRefinement). Within this context, the Reconstructed Human Epidemic (RHE) is amodel capable of simulating the morphological, biochemical and physiologicalcharacteristics of the human epidermis, and can be used for various scientificpurposes, for example, in the evaluation of the toxicity of chemical substances.Although this model is highly accepted in the context of regulatory toxicology, it is stilllittle adopted in academic research, mainly due to high costs, difficulties in acquisitionand limitations of information about the construction protocol. In view of this, ourobjective was to develop a new model of RHE, here referred to as Skinvitro-RHE,through the analysis of factors that potentially influence cultures of RHE (i.e.,coverings of the inserts, cultivation plate, pore density of the inserts, culture medium,culture medium supplements, time in submerged condition, humidity and age ofkeratinocyte donors). From this analysis, we developed an open protocol in order toincrease the accessibility of the RHE model for academic laboratories and studiesthat do not fit the Good Laboratory Practices (GLP) conditions. In addition, as asecondary objective of the study, we evaluated the applicability of this model in thedermal irritation test in vitro, following the OECD TG 439 method. The bestconstruction condition for the RHE was the generation of a model constructed withneonatal keratinocytes, plated in high-density pore inserts and coated with collagenIV. Through this construction protocol, we obtained an RHE highly similar to thehuman epidermis with the four layers of differentiation and well-defined stratumcorneum (~ 7 layers, 66.7 µm thick). In addition, when exposed to differentiationmarkers (Keratin-10, Keratin-14, Filaggrin, Involucrin), it presented a marking patternsimilar to the human epidermis. This model also fits the quality control parametersrecommended by OECD TG 439 and, thus, demonstrated good cell viability (meanoptical density at 570 nm of 1,7 ± 1,08) and barrier function (IC50 of 2,77 ± 0,53mg/ml - Sodium Dodecyl Sulfate). The Skinvitro-RHE was then evaluated for itspotential use for the evaluation of dermal irritation using 15 reference substances (7irritants and 8 non-irritants), usually used in evaluation studies. The results showedthat the Skinvitro-RHE was able to discriminate between irritating and non-irritatingsubstances, with a specificity of 85.71%, sensitivity of 100% and precision of 93.33%.In conclusion, these results demonstrate that the Skinvitro-RHE is a promising,accessible and highly reproducible model, which can be used for skin irritationtesting, as well as other scientific purposes through its open protocol, contributing tothe dissemination and implementation of alternative methods, especially in sectorswhere this 3D model is not yet widespread.