Obtenção, caracterização e validação de biomoléculas como ferramentas para detecção de desreguladores endócrinos e metais tóxicos em Danio rerio

Abstract

Resumo: Testes baseados em imunoensaios aparecem como técnicas promissoras para avaliação da qualidade da água. Ao nível de expressão das proteínas, a Vitelogenina (VTG) e a Metalotioneína (MT) podem ser usadas como imunosensores para detectar poluentes desreguladores endócrinos estrogênicos e metais tóxicos, respectivamente. O atual estudo busca obter, caracterizar e validar as proteínas nativas VTG e MT do organismo modelo D. rerio e seus respectivos anticorpos específicos. As proteínas nativas foram obtidas por meio da exposição hídrica de exemplares machos e fêmeas aos contaminantes 17a-etinilestradiol (EE2) e cloreto de cádmio (CdCl2) e purificadas por cromatografia líquida. Dentre as estratégias para obter a VTG, a Cromatografia por Troca Iônica (CTI) foi a mais eficiente, pois apresentou maior rendimento e melhor grau de pureza entre as cromatografias testadas. Por sofrer degradação devido a condições desnaturantes, a VTG apresenta um padrão multibanda nas análises de SDS-PAGE e western blot. A proteína, que normalmente possui peso molecular próximo a 130 kDa, apresentou vários domínios com pesos moleculares menores, devido ao processo de fragmentação. A CTI também apresentou ser mais eficiente para purificar a MT, visto que foi possível isolar o que parece ser seus dímeros (isoforma I e II) e oligômero (peso molecular ~150 kDa). Como a MT tem alta propensão em formar agregados, que variam de ~14 kDa até ~150 kDa, também é possível observar o padrão multibandas nas análises de SDS-PAGE e western blot. Em seguida, as proteínas purificadas foram adsorvidas em colunas cromatográficas para imunopurificação de anticorpos IgG específicos, provenientes do soro de coelhos. Os anticorpos purificados foram avaliados por SDS-PAGE, biotinilados e validados frente aos extratos proteicos de D. rerio nos ensaios de ELISA e western blot. As tentativas para purificar a IgG foram mal sucedida devida à baixa afinidade e rendimento dos anticorpos. Não foi possível diferenciar a concentração das proteínas do extrato total entre machos e fêmeas por meio do anti- VTG no ELISA e, pelo western blot, se verificou que o anticorpo apresenta reação cruzada com uma proteína de baixo peso molecular (~40 kDa), presente em ambos os sexos. Já o anti-MT apresentou padrão de afinidade baixo diante da MT purificada e do extrato total. Assim, como alternativa, foi realizada a purificação dos anticorpos IgY da gema do ovo de galinhas. Foi possível separar as proteínas solúveis da gema pelo protocolo de extração, sendo que a Cromatografia por Troca Iônica, seguida por Interação Hidrofóbica, conseguem purificar a IgY com alto grau de pureza. Os resultados com a VTG e MT mostram que ainda são necessários ensaios para verificar a estabilidade físico-químico dessas proteínas, visando compreender o perfil que elas apresentam sob condições de pH, aquecimento, congelamento/descongelamento e presença de agentes redutores. Como alternativa, os anticorpos obtidos a partir da gema do ovo poderia ser uma alternativa viável para identificar essas proteínas no ELISA e western blot

Abstract: Tests based on immunoassays appear as promising techniques for water quality assessment. At the level of protein expression, Vitellogenin (VTG) and Metallothionein (MT) can be used as immunosensors to detect estrogenic endocrine-disrupting pollutants and toxic metals, respectively. The current study seeks to obtain, characterize and validate the native proteins VTG and MT of the model organism D. rerio and their respective specific antibodies. The native proteins were obtained through the water exposure of male and female specimens to the contaminants 17a-ethinylestradiol (EE2) and cadmium chloride (CdCl2) and purified by liquid chromatography. Among the strategies to obtain the VTG, the Ionic Exchange Chromatography (IEX) was the most efficient, as it presented the highest yield and the best degree of purity among the chromatographies tested. As it undergoes degradation due to denaturing conditions, VTG presents a multiband pattern in SDS-PAGE and western blot analyzes. The protein, which normally has a molecular weight close to 130 kDa, has several domains with lower molecular weights, due to the fragmentation process. CTI also proved to be more efficient to purify MT, since it was possible to isolate what appears to be its dimers (isoforms I and II) and oligomer (molecular weight ~150 kDa). As MT has a high propensity to form aggregates, ranging from ~14 kDa to ~150 kDa, it is also possible to observe the multiband pattern in SDS-PAGE and western blot analyses. Then, the purified proteins were adsorbed on chromatographic columns for immunopurification of specific IgG antibodies from rabbit serum. The purified antibodies were evaluated by SDS-PAGE, biotinylated and validated against D. rerio protein extracts in ELISA and western blot assays. Attempts to purify the IgG were unsuccessful due to the low affinity and yield of the antibodies. The anti-VTG did not differentiate the concentration of the protein of the total extract between males and females in the ELISA and, by the western blot, it was verified that the antibody presents a cross reaction with a low molecular weight protein (~40 kDa), present in both the sexes. On the other hand, anti-MT showed a low affinity pattern compared to purified MT and total extract. Thus, as an alternative, the purification of lgY antibodies was carried out from the egg yolk of chicken. It was possible to separate the soluble proteins from the yolk by the extraction protocol, and the Ionic Exchange Chromatography, followed by Hydrophobic Interaction, manage to purify the lgy, with a high degree of purity. The results with VTG and MT show that tests are still needed to verify the physicochemical stability of these proteins, in order to understand the profile they present under pH, heating, freezing/thawing conditions and the presence of reducing agents. Alternatively, antibodies obtained from egg yolk could be a viable alternative to identify these proteins in ELISA and western blot