Influência da ADAM23 recombinante na distribuição de GFP-PRPC na membrana de células das linhagens N2a e HEK293T

Abstract

Resumo: A PrPc é uma glicoproteína ancorada em GPI presente em quase todos os tipos celulares e residente dos microdomínios de membrana (lipid rafts). Embora sua expressão seja acentuada no sistema nervoso, onde estabelece interações com parceiros moleculares, executa funções de modulação de toxicidade, modulação sináptica, interferências em vias de sinalização e, em eventos patológicos, está associada à encefalopatias espongiformes transmissíveis. Entre seus parceiros está a ADAM23, uma desintegrina e metaloprotease não catalítica de múltiplos domínios, com expressão quase restrita às células nervosas, durante o período embrionário e na fase adulta. Apesar de não ser residente dos lipid rafts, sua forma madura pode transitar nesses microdomínios de membrana. Assim como a PrPc , a ADAM23 possui relevância para o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso, principalmente pelo potencial de participar na adesão celular e plasticidade sináptica. Diante disso, com o estabelecimento da interação direta entre as duas proteínas e sua co-localização, o presente trabalho buscou investigar a influência da ADAM23 recombinante no deslocamento da GFP-PrPc na membrana de duas linhagens celulares (HEK293T e N2a). Para isso, foi realizada, satisfatoriamente, a purificação da ADAM23 (dis+cys), proteína com marcação 6HIS que possui dois domínios isolados da ADAM23: desintegrina (responsável pela interação com PrPc ) e domínio rico em cisteína (reconhecido pelo anticorpo DL11C8). Esta foi utilizada como ligante, diretamente no meio de cultura, em células expressando GFP-PrPc . Para avaliar o deslocamento nos lipid rafts, foi usada a ultracentrifugação em um gradiente de concentração de Nycodenz. Além disso, visando estabelecer a cinética de internalização, foi utilizada a biotinilação de superfície e posterior purificação dos extratos celulares com Avidina-Agarose. Como metodologia comparativa de interação, foi realizada a co-expressão de GFP-PrPc e ADAM23-Myc-Flag, no mesmo sistema. Nos ensaios de deslocamento com a HEK293T foram verificados padrões indesejados no processamento da GFP-PrPc , o que restringiu as análises ao modelo celular N2a, sendo esta mais promissora no contexto atual. Embora não tenha sido possível realizar ensaios conclusivos acerca da influência da ADAM23 recombinante na endocitose da GFP-PrPc , os resultados do deslocamento revelaram variação na presença da GFP-PrPc na membrana a depender da estratégia metodológica utilizada. Com a co-expressão, a GFP-PrPc foi identificada com mais presença em regiões rafts, indicando possível retenção nesses microdomínios. O oposto ocorreu nos ensaios utilizando o ligante purificado, em que a GFP-PrPc foi deslocada para regiões não rafts. Embora sejam dados parciais, esses resultados podem revelar a complexidade biológica existente na interação ADAM23-PrPc e sugerir diferentes abordagens para explorar a função biológica dessa interação

Abstract: The PrPc is a GPI-anchored glycoprotein present in almost all cell types and residing in membrane microdomains (lipid rafts). Although its expression is particularly prominent in the nervous system, where it interacts with molecular partners, is involved in toxicity modulation, synaptic regulation, signaling pathways, and, under pathological conditions, is associated with transmissible spongiform encephalopathies. Among its partners is ADAM23, a desintegrin and metalloprotease non-catalytic with expression largely restricted to neuronal cells during both embryonic development and adulthood. Although not a resident of lipid rafts, its mature form can traffic through these membrane microdomains. Like PrPc , ADAM23 plays an important role in nervous system development and maintenance, mainly due to its potential participation in cell adhesion. Given the direct interaction and co-localization previously established between these two proteins, the present study aimed to investigate the influence of recombinant ADAM23 on the distribution of GFP-PrPc in the membrane of two cell lines (HEK293T and N2a). For this purpose, ADAM23 (dis+cys) was successfully purified. This protein, tagged with 6HIS, contains two isolated domains of the full-length ADAM23: the disintegrin domain (responsible for interaction with PrPc ) and the cysteine-rich domain (recognized by the DL11C8 antibody). It was used as a ligand directly in the culture medium of GFP-PrPc–expressing cells. To assess displacement within lipid rafts, ultracentrifugation in a Nycodenz gradient was performed. Additionally, to evaluate internalization kinetics, surface biotinylation followed by purification of cell extracts with Avidin-Agarose was carried out. As a comparative interaction strategy, co-expression of GFP-PrPc and ADAM23-Myc-Flag in the same system was also employed. In displacement assays with HEK293T, undesirable processing patterns of GFP-PrPc were observed, restricting the analyses to the N2a cell model, which proved more suitable in the current context. Although conclusive results regarding the effect of recombinant ADAM23 on GFP-PrPc endocytosis could not be obtained, displacement assays revealed variations in GFP-PrPc distribution depending on the methodological approach. Under co-expression, GFP-PrPc showed greater enrichment in lipid rafts, suggesting possible retention in these microdomains. In contrast, incubation with the purified ligand led to its displacement toward non-raft regions. Although partial, these findings highlight the biological complexity of the ADAM23–PrPc interaction and suggest different approaches to further explore the biological significance of this interplay