Caracterização do complexo celulásico de Penicillium echinulatum

Abstract

Resumo: O fungo filamentoso Penicillium echinulatum foi recentemente identificado como umbom produtor de celulases. No entanto,o seu complexo celulásico jamais foi estudado emdetalhes. Neste trabalho, as atividades das celulases de P. echinulatum foramdeterminadas e comparadas ao complexo celulolítico de Trichoderma reesei (Celluclast1.5L FG, Novozymes), empregando substratos como papel de filtro, carboximetilcelulose,hidroxietilcelulose, xilana de madeira de vidoeiro, xilana de endoderma de aveia,Sigmacell tipo 50, celobiose e p-nitrofenil-glucopiranosídeo. Além disso, foramrealizados experimentos de hidrólise com diferentes tipos de substratos para avaliarcomparativamente a eficiência de sacarificação dos complexos celulásicos,a importânciada presença de b-glucosidases,a estabilidade das enzimas nas condições operacionais,operfil de adsorção protéica durante a hidrólise e, também,a influência da hidrólise sobre ograu de polimerização (GP) do substrato. Em linhas gerais, estes complexos apresentaramatividades celulásica total e xilanásica semelhantes. Porém,a análise dos hidrolisadosenzimáticos demonstrou que o complexo de T. reesei possui maior atividadecelobioidrolásica, enquanto o complexo de P. echinulatum apresenta atividade bglucosidásica superior. Experimentos de hidrólise também demonstraram que o complexode P. echinulatum é vantajoso para a sacarificação de substratos celulósicos, pois possuiatividade b-glucosidásica suficiente para remover a celobiose produzida no meioreacional. Porém,o complexo celulásico de T. reesei tornou-se um sistema mais completoxviiRESUMO O fungo filamentoso Penicillium echinulatum foi recentemente identificado como um bom produtor de celulases. No entanto, o seu complexo celulásico jamais foi estudado em detalhes. Neste trabalho, as atividades das celulases de P. echinulatum foram determinadas e comparadas ao complexo celulolítico de Trichoderma reesei (Celluclast 1.5L FG, Novozymes), empregando substratos como papel de filtro, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, xilana de madeira de vidoeiro, xilana de endoderma de aveia, Sigmacell tipo 50, celobiose e p-nitrofenil-glucopiranosídeo. Além disso, foram realizados experimentos de hidrólise com diferentes tipos de substratos para avaliar comparativamente a eficiência de sacarificação dos complexos celulásicos, a importância da presença de ß-glucosidases, a estabilidade das enzimas nas condições operacionais, o perfil de adsorção protéica durante a hidrólise e, também, a influência da hidrólise sobre o grau de polimerização (GP) do substrato. Em linhas gerais, estes complexos apresentaram atividades celulásica total e xilanásica semelhantes. Porém, a análise dos hidrolisados enzimáticos demonstrou que o complexo de T. reesei possui maior atividade celobioidrolásica, enquanto o complexo de P. echinulatum apresenta atividade ß-glucosidásica superior. Experimentos de hidrólise também demonstraram que o complexo de P. echinulatum é vantajoso para a sacarificação de substratos celulósicos, pois possui atividade ß-glucosidásica suficiente para remover a celobiose produzida no meio reacional. Porém, o complexo celulásico de T. reesei tornou-se um sistema mais completo e eficiente quando foi suplementado com atividade b-glucosidásica exógena (Novozym188, Novozymes). Finalmente,a determinação do efeito da hidrólise enzimática sobre oGP da celulose demonstrou que os dois complexos celulásicos exercem suas atividadeshidrolíticas sobr eo substrato de forma semelhante, através de um mecanismo progressivoe sinérgico, removendo camadas de celulose da superfície do substrato sem permitir oacúmulo deoligômeros de massa molar intermediária.xviiie eficiente quando foi suplementado com atividade ß-glucosidásica exógena (Novozym 188, Novozymes). Finalmente, a determinação do efeito da hidrólise enzimática sobre o GP da celulose demonstrou que os dois complexos celulásicos exercem suas atividades hidrolíticas sobre o substrato de forma semelhante, através de um mecanismo progressivo e sinérgico, removendo camadas de celulose da superfície do substrato sem permitir o acúmulo de oligômeros de massa molar intermediária.

Abstract: Penicillium echinulatum has been identified as a potential cellulase producer forbioconversion processes. However, its cellulase system has never been investigated indetail. In this work, the volumetric activities of cellulases from P. echinulatum weredetermined against substrates such as filter paper (0.27 U/mL), carboxymethylcellulose(1.53 U/mL), hydroxyethylcellulose (4.68 U/mL), birchwood xylan (3.16 U/mL), oat speltxylan (3.29 U/mL), Sigmacell type 50 (0.10 U/mL), cellobiose (0.19 U/mL), and pnitrophenyl-glucopiranoside (0.31 U/mL). These values were then expressed in relation tothe amount of protein and compared with the activity profile of Celluclast 1.5L FG(Novozymes). Our results have shown that both enzyme complexes have similar totalcellulase and xylanase activities. Analysis of substrate hydrolysates demonstrated that P.echinulatum enzymes have higher §-glucosidase activity than Celluclast 1.5L FG, whilethe latter enzyme system has greater cellobiohydrolase activity. Hydrolysis experimentsalso demonstrated that the P. echinulatum system is advantageous forthesaccharificationof cellulose substrates because it has enough §-glucosidase activity to remove thecellobiose produced in the reaction medium. However, the cellulase complex from T.reesei became more efficient than P. echinulatum enzymes when it was supplementedwith exogenous b-glucosidase activity (Novozym 188, Novozymes). Both cellulasecomplexes displayed the same influence over the degree of polymerization of cellulose,revealing that hydrolyses were carried out under the typical endo-exo synergism of fungalxvABSTRACT Penicillium echinulatum has been identified as a potential cellulase producer for bioconversion processes. However, its cellulase system has never been investigated in detail. In this work, the volumetric activities of cellulases from P. echinulatum were determined against substrates such as filter paper (0.27 U/mL), carboxymethylcellulose (1.53 U/mL), hydroxyethylcellulose (4.68 U/mL), birchwood xylan (3.16 U/mL), oat spelt xylan (3.29 U/mL), Sigmacell type 50 (0.10 U/mL), cellobiose (0.19 U/mL), and pnitrophenyl-glucopiranoside (0.31 U/mL). These values were then expressed in relation to the amount of protein and compared with the activity profile of Celluclast 1.5L FG (Novozymes). Our results have shown that both enzyme complexes have similar total cellulase and xylanase activities. Analysis of substrate hydrolysates demonstrated that P. echinulatum enzymes have higher ß-glucosidase activity than Celluclast 1.5L FG, while the latter enzyme system has greater cellobiohydrolase activity. Hydrolysis experiments also demonstrated that the P. echinulatum system is advantageous for the saccharification of cellulose substrates because it has enough ß-glucosidase activity to remove the cellobiose produced in the reaction medium. However, the cellulase complex from T. reesei became more efficient than P. echinulatum enzymes when it was supplemented with exogenous ß-glucosidase activity (Novozym 188, Novozymes). Both cellulase complexes displayed the same influence over the degree of polymerization of cellulose, revealing that hydrolyses were carried out under the typical endo-exo synergism of fungal enzymes, promoting the progressive peeling of cellulose molecules from the surface of the substrate without accumulating any detectable short cellooligomers in the hydrolysis mixture.