Study of the mechanism of new inhibitors derived from indeno [1,2-b] indoles chromones and polyoxovanadates of P-Glycoprotein and ABCG2 transporters
Resumo
Resumo: Os transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC) constituem uma superfamília de proteínas de membrana que está envolvida na resistência a múltiplas drogas (MDR). Entre as 48 proteínas ABC codificadas no genoma humano, a glicoproteína P (P-gp/ABCB1), a multidrug resistance associated protein 1 (MRP1/ABCC1) e a proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP/ABCG2) apresentam forte relevância clínica, com comprovado envolvimento na resistência ao tratamento do câncer. O presente estudo avaliou compostos de diferentes classes químicas, incluindo indeno[1,2-b]indoles, cromonas e polioxovanadatos. Dezoito novos derivados de indeno[1,2-b]indoles foram estudados como inibidores do transportador ABCG2. Estes compostos mostraram um padrão de inibição parcial (Imax < 80%) e total (Imax >= 80%). Com base na razão terapêutica (TR - citotoxicidade/potência de inibição), foi investigado o mecanismo de inibição dos melhores inibidores parciais (5e e 6a) e totais (6c e 6d). O ensaio de docking revelou que os indeno[1,2-b]indoles compartilham o mesmo sítio de ligação em ABCG2 que o Ko 143 e a estrona-3-sulfato. Esses compostos estimulam a atividade da ATPase e o ensaio de estabilidade térmica revelou mudanças conformacionais para uma forma mais estável da proteína. Os derivados de indeno[1,2-b]indoles não foram transportados por ABCG2 e apenas o derivado 6a foi seletivo para ABCG2. Curiosamente, tanto os inibidores parciais quanto os totais sensibilizam totalmente as células que super expressam o transportador ABCG2. A cromona 4a apresentou uma inibição total do transportador ABCG2 utilizando diferentes substratos, indicando que este inibidor não é dependente de substrato. A cromona 4a foi seletiva para ABCG2 e promoveu mudanças conformacionais para uma forma ligeiramente estável da proteína, conforme revelado pelo ensaio de estabilidade térmica. Diferentemente do Ko 143, a cromona 4a estimulou a atividade ATPase e não aumentou a ligação do anticorpo 5D3. No entanto, o docking e um ensaio de competição demonstraram uma sobreposição entre o sítio de ligação do Ko 143 e da cromona 4a em ABCG2. Diferentes polioxovanadatos (POVs) foram testados como inibidores da P-gp, MRP1 e ABCG2. Todos os compostos foram seletivos para inibir a P-gp. Os dois melhores inibidores foram os POVs V10 e V18. Estes compostos não foram transportados pela P-gp e apresentaram inibição da atividade ATPase. O ensaio com anticorpo conformacional sugeriu que os POVs podem desencadear diferentes mudanças conformacionais na P-gp. O acúmulo intracelular desses compostos é dependente do tempo, atingindo um plateau após 4h de incubação. Além disso, esses compostos produzem diferentes espécies em meio de cultura. Em resumo, descrevemos inibidores promissores dos transportadores ABCG2 e P-gp com potencial para avançar em estudos pré-clínicos.Diferentemente do K ol43, a cromona 4a estimulou a atividade ATPase e não aumentou a ligação do anticorpo 5D3. No entanto, o docking e um ensaio de competição demonstraram uma sobreposição entre o sítio de ligação do Kol43 e da cromona 4a em ABCG2. Diferentes polioxovanadatos (POVs) foram testados como inibidores da P-gp, MRP1 e ABCG2. Todos os compostos foram seletivos para inibir a P-gp. Os dois melhores inibidores foram os POVs V10 e V18. Estes compostos não foram transportados pela P-gp e apresentaram inibição da atividade ATPase. O ensaio com anticorpo conformacional sugeriu que os POVs podem desencadear diferentes mudanças conformacionais na P-gp. O acúmulo intracelular desses compostos é dependente do tempo, atingindo um plateau após 4h de incubação. Além disso, esses compostos produzem diferentes espécies em meio de cultura. Em resumo, descrevemos inibidores promissores dos transportadores ABCG2 e P-gp com potencial para avançar em estudos pré-clínicos. Abstract: The ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute a membrane protein superfamily that are involved in multidrug resistance (MDR). Among the 48 ABC proteins encoded in the human genome, P-glycoprotein (V-gp/ABCB1), multidrug resistance associated protein 1 (MRP1/ABCC1), and breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) have strong clinical relevance due the involvement in cancer resistance. The current study evaluated compounds from different Chemical classes, including indeno[1,2-b]indoles, chromones and polyoxovanadates. Eighteen new indeno[1,2-b]indoles derivatives were studied as ABCG2 inhibitors. These compounds showed a partial (Imax < 80%) and total (Imax . 80%) inhibition pattern. Based on the therapeutic ratio (T R - cytotoxicity/potency of inhibition), the mechanism of inhibition of the best partial (5e and 6a) and total (6c and 6d) inhibitors were investigated. The docking assay suggested that the indeno[1,2-b]indoles share the same binding site on ABCG2 that Ko 143 and estrone-3-sulfate. These compounds stimulate the ATPase activity and the thermostability assay revealed conformational changes to a more stable form. The indeno[1,2-b]indoles derivatives were not transported by ABCG2 and only 6a was selective toward ABCG2. Interestingly, both partial and total inhibitors fully chemosensitize cells overexpressing ABCG2. The chromone 4a showed a total ABCG2 inhibition behavior using different substrates, indicating that this inhibitor is not substrate dependent. Chromone 4a was selective toward ABCG2 and promoted conformational changes to a slightly stable form, as revealed by thermostability assay. Differently to Ko 143, chromone 4a stimulated the ATPase activity and do not increased the 5D3 antibody binding. However, docking and a competition assay demonstrated an overlap between Ko 143 and chromone 4a binding sites on ABCG2. Different polyoxovanadates (POVs) were tested as inhibitors of P-gp, MRP1 and ABCG2. Ali compounds were selective toward P-gp. The two best inhibitors were POVs V10 and V18. These compounds were not transported by P-gp and showed an inhibition of the ATPase activity. The conformational antibody assay suggested that V10 and V18 can trigger different conformational changes on P-gp. The intracellular accumulation of these compounds was time-dependent, reaching a plateau after 4h incubation. In addition, these compounds produce different species in culture medium. In summary, we described promising ABCG2 and P-gp inhibitors with potential to advance in preclinical studies.
Collections
- Teses [105]