Cultivo de células ascíticas do tumor de Walker 256 na presença de óleo de peixe-BSA complexado : efeitos sobre proliferação e morte celular e seus mecanismos de ação

Abstract

O consumo excessivo de gorduras saturadas e de ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) n-6 associado à baixa ingestão de AGPI n-3, facilitam o desenvolvimento de câncer. Vários estudos mostram que dietas com baixo teor de gordura, ricas em AGPI n-3, podem prevenir o desenvolvimento e progressão do câncer e que estes ácidos têm efeito significativo sobre crescimento e proliferação celular, exibindo atividade anti-tumoral em diversas linhagens de células cancerosas e também sobre o tumor de Walker 256, in vivo. A atividade anti-tumoral exercida pelo óleo de peixe tem sido aventada como resultado da inibição do crescimento celular e/ou do aumento da apoptose das células tumorais. Os AGPI n-3 podem atuar sobre genes e vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento tumoral. A via da MAPK ERK é uma das mais importantes para proliferação celular e há evidências de que esta via esteja envolvida na patogênese e progressão de tumores. Outra quinase serinatreonia envolvida com progressão tumoral é a PKB/Akt, a qual tem ação antiapopt ótica, contribuindo para sobrevivência celular. Ainda, as proteínas Bax (pró- apoptótica) e Bcl-2 (anti-apoptótica) também têm sido mostradas participarem do desenvolvimento tumoral. A ação inibitória das dietas ricas em AGPI n-3 sobre o crescimento tumoral pode ocorrer também via peroxidação lipídica. Neste estudo investigamos in vitro, os possíveis agentes intracelulares arrolados como participantes das vias de apoptose e mitogênese. Para tanto, células ascíticas do tumor de Walker 256 foram cultivadas em meio de cultura RPMI-1640 (Meio), na presença do veículo albumina sérica bovina 2% (BSA) ou do óleo de peixe complexado à BSA (OP). Foram analisadas a proliferação das células, através da incorporação de [2- elevado a 14C]-timidina em DNA; apoptose e necrose por citometria de fluxo; peroxidação lipídica pelo método FOX; atividade da enzima catalase; expressão de proteínas envolvidas na sinalização de morte (Bcl-2 e Bax) e de proliferação celular (PKB/Akt e ERK 1/2). O óleo de peixe-BSA complexado (OP) foi capaz de reduzir a proliferação das células tumorais em 4 vezes e aumentar em 20 vezes a morte destas células, por apoptose ou necrose, quando comparadas às das células cultivadas apenas em meio de cultura e BSA. Estas ações do óleo de peixe sobre as células tumorais envolveu uma elevação da taxa de peroxidação lipídica, que foi aproximadamente 4 vezes maior, redução da atividade da catalase em aproximadamente 6 vezes e diminuição significativa na expressão das proteínas PKB/Akt, ERK 1/2 e Bcl-2. A proteína Bax não teve sua expressão alterada na presença de óleo de peixe-BSA complexado. Todos estes mecanismos de ação do óleo de peixe parecem interligados, e sua ação anti-tumoral parece ser a somatória de mudanças na composição da membrana, alterações nas vias de transdução de sinais e talvez na expressão de genes que levam a sinais de proliferação e apoptose.

The increased consumption of saturated fat and n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFA) along with reduction of n-3 PUFA favors tumors development. Several studies indicate that low fat diets, rich in n-3 PUFA, prevent the development and progression of tumors in several lineages and also suppress cell growth and proliferation in Walker 256 tumor, in vivo. Tumor growth reduction by n-3 PUFA can occur either by the inhibition of cellular proliferation and/or by the induction of necrotic or apoptotic cell death. The n-3 PUFA effects could be on gene expression and signal transduction pathways involved in tumor development. The ERK MAPK pathway is one of the most important for cell proliferation and this pathway is involved in the pathogenesis and progression of cancer. PKB/Akt is another serinethreonine protein kinase that has been implicated in tumor progression having an antiapoptotic action, therefore contributing to cell survival. Bax (pro-apoptotic) and Bcl-2 (antiapoptotic) proteins have also been associated with tumor development. The n-3 PUFA antitumor effect can also occur through lipid peroxidation. The present study investigate, in vitro, the possible intracellular mechanisms involved in apoptosis and mitogenesis pathways. Walker 256 tumor ascitic cells were seeded in RPMI-1640 culture medium (Medium), in the presence of bovine seric albumin 2% (BSA) or fish oil-BSA complex (FO). The followig assays were performed: cell proliferation by [2- to the power of 14C]-thymidine incorporation into DNA, apoptosis and necrosis by flow cytometry, lipid peroxidation by FOX method, catalase enzime activity, expression of proliferation-associated (PKB/Akt, ERK 1/2) and cell death-associated (Bcl-2, Bax) proteins. Fish oil-BSA complex was able to reduce in about four-fold the tumor cell proliferation and increase in 20-fold the cell death when compared to untreated cells (Medium and BSA). The fish oil effects involved lipid peroxidation increase and reduction of the catalase enzime activity, along with PKB/Akt, ERK 1/2 and Bcl-2 proteins expression. Bax expression was not changed. We suggest that all these mechanisms are interconnected and the antitumor activity of fish oil might be due to the combination of cell membrane fluidity and signaling transduction pathways alteration with proliferative and apoptotic gene expression modification.