O repertório de linfócitos B e a variação de genes relacionados à maturação e desenvolvimento dessas células em pênfigo foliáceo endêmico

Abstract

Resumo: O pênfigo foliáceo (PF) é uma doença autoimune mediada por células B e autoanticorpos contra a desmogleina 1, uma molécula de adesão celular dos queratinócitos. Apesar de rara no mundo, apresenta alta incidência e prevalência em algumas regiões do Brasil, nas quais essa doença é endêmica. Por ser uma doença de etiologia complexa, diversos fatores genéticos e ambientais estão envolvidos na patogênese de PF. O primeiro objetivo desse estudo foi avaliar o impacto da variação de genes que codificam moléculas envolvidas no desenvolvimento das células B e na produção de anticorpos na suscetibilidade ao PF. Analisamos 3.336 polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) em 167 genes candidatos em um estudo do tipo casocontrole em uma amostra de 227 pacientes de PF e 193 controles. Encontramos 10 variantes intrônicas ou intergênicas associadas à uma maior suscetibilidade ao PF (OR > 1,56; p < 0,005): rs6657275*G (TGFB2); rs1818545*A (RAG1/RAG2/IFTAP); rs10781530*A (PAXX), rs10870140*G e rs10781522*A (TRAF2); rs535068*A (TNFRSF1B); rs324011*A (STAT6); rs6432018*C (YWHAQ); rs17149161*C (YWHAG); e rs2070729*C (IRF1). A partir de análises in silico constatamos que estes SNPs foram anteriormente associados à expressão diferencial, indicando que podem ter um impacto no funcionamento normal das vias moleculares nas quais essas moléculas participam. O segundo objetivo deste trabalho foi caracterizar o repertório de imunoglobulinas em pacientes de PF e controles. Estudamos três subgrupos de pacientes (n = 16), controles da área endêmica (n = 6) e controles de uma área não endêmica (n = 4). Após o isolamento de RNA total a partir de células mononucleadas do sangue periférico, realizamos o sequenciamento da região variável (exon VDJ) da cadeia pesada de imunoglobulinas IgG e IgM. Encontramos que tanto pacientes quanto indivíduos saudáveis que vivem em áreas endêmicas apresentam uma diversidade reduzida do repertório de células B em comparação com indivíduos saudáveis de uma região não endêmica, sugerindo uma possível alteração do repertório por características ambientais específica da região endêmica. Identificamos que os segmentos gênicos IGHV3-23 e IGHV3-30 têm expressão reduzida e aumentada, respectivamente, em pacientes com doença ativa comparados à indivíduos sem a doença (p < 0,04). Observamos que os pacientes apresentaram sequências da região CDR3 que desviaram da distribuição normal, com maior frequência de sequências mais longas. Ainda, realizamos uma cuidadosa análise de similaridades de sequências CDR3 e identificamos dois agrupamentos específicos de PF, o que pode ser informativo quanto aos anticorpos relevantes para a doença e podem ser possíveis alvos terapêuticos no futuro. Pela primeira vez, mostramos que os polimorfismos nos genes envolvidos no desenvolvimento de células B e na produção de anticorpos conferem suscetibilidade diferencial ao PF endêmico. Ainda, fomos os primeiros a demonstrar diferenças no repertório de células B em pacientes e controles e também diferenças potencialmente causadas por fatores ambientais da área endêmica de PF. Por ser uma doença negligenciada e pouco compreendia, a caracterização do repertório de células B em PF pode contribuir na elucidação da patogênese dessa doença, assim como também ajudar na identificação dos fatores ambientais que desencadeiam a doença em indivíduos geneticamente susceptíveis. Nossos resultados representam um grande avanço e podem servir de base para estudos futuros que venham a focar no desenvolvimento de terapias mais eficazes e com menos efeitos adversos do que as convencionais corticoterapias.

Abstract: Pemphigus foliaceus (PF) is an autoimmune disease mediated by B cells and autoantibodies against desmoglein 1, a cell adhesion molecule of keratinocytes. Although rare in the world, PF exhibits high incidence and prevalence in some endemic regions of Brazil. Because it is a complex disease, several genetic and environmental factors are involved in the pathogenesis of PF. The first aim of this study was to evaluate the impact of variation in genes encoding molecules involved in B-cell development and antibody production on susceptibility to PF. We analyzed 3,336 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 167 candidate genes in a casecontrol study in a sample of 227 FP patients and 193 controls. We found 10 intronic or intergenic variants associated with increased susceptibility to PF (OR > 1.56; p < 0.005): rs6657275*G (TGFB2); rs1818545*A (RAG1/RAG2/IFTAP); rs10781530*A (PAXX), rs10870140*G and rs10781522*A (TRAF2); rs535068*A (TNFRSF1B); rs324011*A (STAT6); rs6432018*C (YWHAQ); rs17149161*C (YWHAG); and rs2070729*C (IRF1). According to our in-silico analyses, these SNPs were previously associated with differential expression of the genes, indicating that they may have an impact on the functioning of their molecular pathways. The second aim of this work was to characterize the immunoglobulin repertoire in PF patients and controls. We studied three subgroups of patients (n = 16), controls from the endemic area (n = 6) and controls from a non-endemic area (n = 4). After isolation of total RNA from peripheral blood mononucleated cells, we performed sequencing of the variable region (exon VDJ) of the IgG and IgM immunoglobulin heavy chain. We found that both patients and healthy individuals living in endemic areas show reduced B-cell repertoire diversity compared with healthy individuals from the non-endemic region, suggesting a possible alteration of the repertoire caused by environmental characteristics of the endemic region. We identified that the IGHV3-23 and IGHV3-30 gene segments have reduced and increased expression, respectively, in patients with active disease compared to individuals without the disease (p < 0.04). We observed that patients the CDR3 region sequence distribution deviated from the normal distribution, with higher frequencies of longer sequences. In addition, we performed a careful similarity analysis of CDR3 sequences and identified two specific clusters in PF patients, which may be informative about antibodies relevant to the disease and may be possible therapeutic targets in the future. For the first time, we showed that polymorphisms in genes involved in B-cell development and antibody production confer differential susceptibility to endemic PF. Furthermore, we were the first to demonstrate differences in the B-cell repertoire in patients and controls and also differences potentially caused by environmental factors in the PF endemic area. As a neglected and poorly understood disease, the characterization of the B-cell repertoire in FP may contribute to elucidate the pathogenesis of this disease, as well as help in the identification of environmental factors that trigger the disease in genetically susceptible individuals. Our results represent an advance in the study of this diease and may serve as a basis for future studies focusing on the development of more effective therapies with fewer adverse effects than the conventional corticotherapies.