Alteração da expressão gênica e das respostas fisiológicas de macrófagos peritoneais de camundongos pelo canova

Abstract

Resumo: Canova (CA) é um medicamento derivado das tinturas de: Aconitum, Bryonia, Thuya, Lachesis e Arsenicum diluídos em água destilada e menos de 1% de álcool. Preparado a partir de técnicas homeopáticas, não apresenta toxicidade nem efeitos colaterais. CA tem sido indicado a pacientes onde o sistema imunitário está debilitado, e vem apresentando bons resultados na clínica. Experimentos anteriores em nosso laboratório comprovaram que macrófagos tratados com CA apresentam-se ativados. Portanto, com esse trabalho pretendemos elucidar algumas modificações celulares ocorridas durante o tratamento com CA. Foram utilizados dois tipos de tratamento: camundongos tratados (in vivo) e macrófagos peritoneais de camundongos tratados com CA (in vitro). Os macrófagos foram coletados e processados para experimentos de detecção da atividade enzimática, assim como seus produtos (microscopia eletrônica de transmissão – MET, leitura de absorbância e marcação com laranja de acridina), detecção de CD74 (Ii) através de citometria de fluxo e MET, produção de citocinas através de citometria de fluxo e expressão gênica, através do isolamento de RNA e sua hibridização em Gene Chips®. Os macrófagos tratados com CA apresentaram aumento da atividade da NADH oxidase e da óxido nítrico sintase induzível (iNOS), aumentando conseqüentemente a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO) respectivamente. Observou-se o aumento da quantidade de vesículas ácidas e a diminuição da expressão do CD74 (Ii). Foram observadas diminuições na produção das interleucinas 2 (IL-2) e 4 (IL-4). Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram observados nas células de camundongos tratados com CA. Esses genes estão principalmente relacionados com: processos de transcrição/tradução, estrutura/ dinâmica celular, resposta imunitária, citoproteção, processos enzimáticos e receptores/ligantes. A partir dessas análises podemos concluir que o CA provoca reações celulares que envolvem desde ativação da produção de determinadas moléculas até alterações no perfil de expressão de genes relacionados com a ativação de macrófagos.

Abstract: Canova (CA) is a medication composed of Aconitum, Bryonia, Thuya, Lachesis and Arsenicum in distilled water containing less than 1% ethanol. It is produced with homeopathic techniques and is neither toxic nor presents collateral effects. CA is being used by patients where the immune system is depressed, presenting good clinical results. Previous studies demonstrated that CA activates macrophages. Therefore with this work we try to elucidate some cellular modifications triggered by CA. Two treatment types were performed: mice treated (in vivo) and mice macrophages treated with CA (in vitro). Peritoneal cells were collected and processed to enzymatic activity detection and release of its products (transmission electron microscopy – MET, absorbance reading, and acridine orange staining), CD74 (Ii) expression by flow citometry and MET, cytokine production by flow cytometry and gene expression, by RNA isolation and its hybridization into Gene Chips®. Macrophages triggered with CA increased NAD(P)H oxidase activity as well as that of inducible nitric oxide syntase (iNOS), consequently producing reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) respectively. We observed an increase in acid vesicles and a decrease in CD74 (Ii) expression. We also found a decrease in interleukin 2 (IL-2) and 4 (IL-4) production. Differently expressed genes (DEGs) were observed in cells from the treated group. These genes are mainly involved in transcription/translation, cell structure and dynamics, immune response, cytoprotection, enzymatic process and receptors/ligands. From these analyses we can conclude that CA triggers cellular reactions that involve activation of specific molecules production and alterations in gene expression profile related with macrophages activation.