Análise de regiões ultraconservadas transcritas (T-UCRs) no câncer e mama

Abstract

Resumo: No mundo todo, o câncer de mama é a neoplasia mais frequente entre as mulheres e compreende um grupo heterogêneo de doenças, resultando em prognósticos e respostas clínicas distintas. Atualmente existem vários sistemas de classificação, sendo um dos mais usados o baseado em imunoistoquímica. Nessa classificação os tumores de mama são divididos em quatro grupos principais: luminal A, luminal B, HER2+ e triplo negativo. Apesar da classificação, ainda há uma heterogeneidade dentre os pacientes de cada grupo, fazendo com que o curso da doença e a resposta ao tratamento se diversifique. No genoma humano, foram identificadas 481 regiões ultraconservadas (UCRs) que apresentam 100% de identidade entre humanos, camundongos e ratos, e também com alta taxa de conservação em outras espécies. Tais regiões possuem de 200-781 pares de bases. Essas regiões podem ser transcritas (TUCRs: transcribed ultraconserved regions), e alterações em seus perfis de expressão têm sido associados a doenças, incluindo alguns tipos de tumores, porém, pouco se sabe da influência dessas regiões no câncer de mama. Além disso, apenas 4% dos transcritos foram totalmente descritos. Na busca por entender melhor o papel desses transcritos no desenvolvimento do câncer de mama, o nível de expressão das 481 T-UCRs foi analisado através de dados depositados no banco TCGA (The Cancer Genome Atlas). Através dessa análise foi verificado que a expressão diferencial de 302 (~63%) das T-UCRs estão associadas com algum parâmetro envolvido no desenvolvimento do câncer de mama como: subtipo molecular (43,45%), receptor de estrógeno (35,76%), receptor de progesterona (32,85%), amplificação de HER2 (16,63%), estadiamento (12,47%), terapia (36,59%) e sobrevida (9,56%). Dessas regiões analisadas fizemos um filtro em busca de regiões que estavam expressas em mais de 80% da amostra, localizadas em regiões intronicas e intergênicas, e qua apresentavam diferença de expressão enre subtipos para a confirmação da diferença de expressão em pacientes brasileiras (n=102) por RT-qPCR, e obtivemos a confirmação da diferença de expressão entre subtipos das regiões uc.147 e uc.193. O transcrito uc.147 está em uma região intrônica do gene LRBA, sendo transcrita no sentido contrário desse gene, e com expressão restrita ao núcleo. Já o transcrito uc.193 está na região 3'UTR do gene SYNCRIP, transcrita no sentido oposto desse gene, e com localização predominante citoplasmática. Adicionalmente, o aumento de expressão da uc.147 foi associada com uma pior sobrevida entre os pacientes luminal A. Com as técnicas de northern blotting e rapid amplification of cDNA ends (RACE), identificamos e descrevemos um transcrito de ~2800nt para a uc.147. O silenciamento da uc.147 nas linhagens celulares do subtipo luminal CAMA-1 e BT474, diminuiu a viabilidade celular. Além disso, na linhagem luminal A CAMA- 1, esse silenciamento também provocou uma diminuição na formação de colônias, aumentou a apoptose e provocou uma parada na fase G1 do ciclo celular. Essas alterações não foram vistas quando o gene LRBA foi silenciado, sugerindo um importante papel do uc.147 em câncer de mama. Adicionalmente, através do ensaio de pull-down nós observamos que existem muitas proteínas que interagem fisicamente com o transcrito e estão envolvidas no processo de tumorigênese. Esse trabalho é o primeiro a fazer uma análise global das T-UCRs em câncer de mama, e o primeiro a caracterizar e sugerir uma importante função 9 ao uc.147, além de apresentar um potencial como biomarcador de prognóstico no câncer de mama. Palavras-chave: Câncer de mama. T-UCRs. Biomarcadores. Tumorigênese.

Abstract: Breast Cancer (BC) is the most commonly diagnosed cancer and the leading cause of cancer death among women. BC is a heterogeneous disease with a rage of clinical and molecular characteristics. There are many classification systems for BC. Based on immuno-histochemical analysis, BC is subdivided in four main groups: luminal A, luminal B, HER2 and triple negative. Although, the number of BC classification system and the stratification of patients improved the therapy, inside of each subtype, patients can still have different outcomes. So, the identification of new biomarkers is important to a better prognosis, and development of more specific therapy. There are 481 ultra-conserved regions (UCRs) described in the genome, being longer than 200bp and 100% conserved among human, rat, and mouse. Most UCRs are transcribed (T-UCR) and some are differentially expressed in tumors. In addition, T-UCRs have already been described participating of the tumorigenesis process. However, the influence that T-UCRs impose on BC remains unclear. Furthermore, only 4% of T-UCRs present information on molecular details. Through analysis of all T-UCRs in the TCGA (The Cancer Genome Atlas) BC data, we found 302 regions associated with important clinical features in BC: 43% associated with molecular subtype, 36% of estrogen-receptor-positive, 17% with ERBB2 expression, 12% with clinical staging and 10% with overall survival. Looking for regions that were expressed in more than 80% of the samples, located in noncoding region and with a greater difference among subtypes we chose 12 T-UCRs to confirm differential expression in Brazilian patients (n=102) by RT-qPCR. We confirmed the differential expression among subtypes in uc.147 and uc.193. Furthermore, the strand specific RT-qPCR indicated that uc.147 and uc.193 are transcribed in the opposite direction from their host genes, LRBA and SYNCRIP, respectively. RT-qPCR. Through subcellular fractionation we demonstrated that uc.147 is located in the nucleus and uc.193 is most cytosolic. Additionally, high expression of uc.147 is associated with poor survival in luminal A patients. Northern blotting results indicated that the uc.147 transcript is around 2800nt and its sequence was confirmed by rapid amplification of cDNA ends (RACE). In addition, the silencing of uc.147 in luminal cell lines CAMA-1 and BT474 reduces cell viability, and in luminal A CAMA-1 cells the silencing reduces colony formation, increases apoptosis, and arrests cells in G1 phase of cell cycle. The same effects are not observe knocking down the LRBA. Besides, using pull-down assay we discover that many proteins associated with tumorigenesis process are binding to uc.147. This study is the first screening of all T-UCRs in BC, the first to characterize uc.147, and demonstrate its potential as prognostic marker in BC. Keywords: Breast Cancer. T-UCRs. Tumorigenesis. Biomarker.