Detecçao e quantificaçao do vírus da Hepatite C através de RT-PCR em tempo - real

Abstract

O vírus da hepatite C (HCV) acomete cerca de 170 milhões de pessoas em todo mundo, causando cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. É a principal causa de indicação de transplante hepático entre adultos. Em complementação aos testes diagnósticos sorológicos existentes, tem-se utilizado testes moleculares para a detecção sérica do RNA do HCV bem como para sua quantificação. No presente trabalho aplicou-se a metodologia de RT-PCR em tempo real para a detecção e quantificação sérica do RNA do HCV. Utilizou-se a plataforma ABI 7000 SDS® e sondas TaqMan® como base tecnológica para o desenvolvimento deste teste. Foram realizadas 84 reações de extração de RNA viral, seguidas de reação de transcrição reversa e subseqüente reação de PCR em tempo real. A sensibilidade analítica do teste foi estimada em 50 UI/ml; a média do coeficiente de variação (CV) intra-ensaio e inter-ensaio foi de 0,42% e 1,8 % respectivamente e a faixa de quantificação abrangeu cerca de 6 log10. A metodologia empregada foi capaz de detectar os três genótipos predominantes no Brasil. Em uma comparação com o teste diagnóstico Amplicor HCV Monitor®, baseado em RT-PCR competitiva e rotineiramente utilizado em laboratórios de diagnóstico, os testes demonstraram um ótimo coeficiente de correlação (r=0,91, p<0,001). No entanto, a concordância, avaliada através da metodologia desenvolvida por Bland-Altman, foi considerada insuficiente para que os testes pudessem, eventualmente, ser utilizados de modo intercambiável. As características apresentadas pelo teste desenvolvido neste trabalho o credenciam como método diagnóstico qualitativo e quantitativo para a hepatite C. Contudo, o ix presente teste necessita ainda de dois desenvolvimentos complementares para ser considerado para uso clínico: construção de um calibrador interno para controle de todas as fases da metodologia empregada e calibração frente um painel validado quantitativo que expresse os resultados em Unidades Internacionais (UI/ml).

Hepatitis C virus is estimated to infect roughly 170 million people worldwide, and is known to cause liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. It is currently the most frequent indication for liver transplantation among adults. In addition to the current serologic assays utilized, molecular biology assays have being developed for RNA HCV detection and quantification. In the present study, real-time RT-PCR was utilized for RNA HCV serum detection and quantification. It was based on ABI 7000 SDS® and TaqMan® probes technology. Eighty four viral RNA extraction reactions, followed by reverse transcription real-time PCR reactions, were conducted. An estimated analytical sensitivity of 50 UI/ml, an average intra-assay and inter-assay coefficients of variation (CV) of 0,42% and 1,80%, respectively, and a 6-log dynamic range were found. The method was capable of detecting all three major HCV genotypes found in Brazil. Comparison of the results with those obtained by Amplicor HCV monitor®, a competitive RT-PCR based assay, routinely used in diagnostic laboratories, revealed significant coefficient of correlation (r=0,91, p<0,001). Nevertheless, agreement, evaluated through Bland-Altman methodology, was considered poor, meaning that both assays should not be used interchangeably. The performance characteristics showed by the present developed assay, confers it as potential qualitative and quantitative method for hepatitis C diagnostics. Notwithstanding, it’s thought that two further complements are in need to the present work before being considered for clinical use: development of an internal calibrator xi for all stages control of the method; and calibration against a validated quantitative panel expressing results in International Units (IU/ml).