Avaliação do potencial biológico do suco de limão tahiti (Citrus latifolia) no controle do fluxo menstrual
Resumo
Resumo: A menstruação é caracterizada como um processo inflamatório, o qual é iniciado pela queda dos níveis de progesterona e estrógeno, juntamente com o processo de regressão do corpo lúteo, levando a síntese de mediadores pró-inflamatórios, como as prostaglandinas (PGs), sendo PGF2? e PGE2 encontradas em grandes quantidades no sangue menstrual, atuando na vasoconstrição e vasodilatação do músculo liso e vasos sanguíneos. Desordens menstruais como a menorragia têm sido associada a irregularidades nos níveis dessas PGs. Estudos preliminares em nosso grupo de estudo mostram que o suco de limão Tahiti (Citrus latifolia) reduz o sangramento menstrual. Frutos de citros são ricos em flavonoides, os quais são potentes antiinflamatórios naturais, levantando a hipótese de que o mecanismo de regulação do sangramento excessivo pode ser controlado pela ação desses. Diante disso, este trabalho teve como objetivos: Desenvolvimento de um método por SPE-LC-MS/MS para quantificação dos níveis de PGF2? e PGE2 em fluido menstrual de dois grupos de amostra: controle (sem tratamento) e tratamento (suplementação com suco de limão Tahiti). As PGs foram capturadas em cartucho OASIS HLB por 3 minutos para limpeza e enriquecimento, e então transferidas durante apenas 42 segundos para uma coluna analítica HSS T3 C18, para separação. As prostaglandinas (PGs) foram detectadas pelo modo SRM negativo, PGE2 (m/z 351 ? 315) e PGF2? (m/z 353 ? 193) usando padrão interno marcado isotopicamente (PGE2-d4, m / z 355 ? 319). A faixa de linearidade foi de 10,34 - 1,034 ng e o limite inferior de quantificação (LLOQ) foi de 10,34 ng para ambas as PGs. Parâmetros de validação foram avaliados com sucesso de acordo com as normativas da European Medicines Agency (EMA). O método não apresentou efeito matriz e a eficiência de processo foi em torno de 100%; com apenas 15 minutos de tempo de análise, possibilitando baixo consumo de solvente. Como segundo objetivo foi realizada a caracterização química dos compostos do suco de limão Tahiti e sua atividade de inibição in vitro frente às enzimas ciclo-oxigenases. Para o suco de limão foram identificados por LC-MS/MS (QqTOF) nove flavonoides O/C-glicosilados: 3 flavanonas (eriocitrina, hesperidina e naringina), 1 flavonol (rutina) e 5 flavonas (diosmina, luteolina 7-O-rutinose, vitexin 2''-O-rhamnoside e vicenina-2); por abordagens de comparação com padrão e desreplicação. O suco de limão mostrou forte inibição frente as enzimas COX-1 e COX-2. Palavras-chave: Desordens menstruais. Prostaglandinas. Suco de limão Tahiti. Citrus latifolia. Flavonoides glicosilados. Ciclo-oxigenases 1 e 2. SPE-LC-MS/MS. SRM. LC-MS/MS. Desreplicação. Abstract: Menstruation is characterized as an inflammatory process, which is triggered by the drop in progesterone and estrogen levels, along with corpus luteum regression, leading to pro-inflammatory mediator synthesis, such as prostaglandins (PGs), PGF2? and PGE2 are found in large quantities in the menstrual blood and act on vasoconstriction and vasodilation of smooth muscle and blood vessels. Menstrual disorders such as menorrhagia have been associated with irregularities in PGF2? and PGE2 levels. Preliminary studies in our research group show that Tahiti lemon juice (Citrus latifolia) reduces the menstrual bleeding. Citrus fruits are rich in flavonoids, which are potent natural anti-inflammatories, raising the hypothesis that the regulation of excessive bleeding mechanism could be controlled by their action. For this, the objectives of this work was: to develop a method by SPE-LC-MS/MS to quantify the PGF2? and PGE2 levels in menstrual fluid of two sample groups: control (without treatment) and treatment (supplementation with Tahiti lemon juice). The PGs were trapped on an OASIS HLB cartridge for 3 minutes for cleanup and enrichment, and then transferred during only 42 seconds to a HSS T3 C18 analytical column, for separation. Prostaglandins (PGs) were detected by SRM negative mode, PGE2 (m/z 351 ? 315) and PGF2? (m/z 353 ? 193) using isotope-labeled internal standard (PGE2-d4, m/z 355 ? 319). The concentration linear range was of 10.34 - 1.034 ng and the lower limit of quantification (LLOQ) was 10.34 ng for both PGs. Validation parameters were successfully assessed according to European Medicines Agency guideline (EMA). The method showed no matrix effect and process efficiency around 100%, in addition to only 15 minutes of analysis time with lower solvent consumption. The second objective was the chemical characterization of Tahiti lemon juice compounds, as well as their in vitro inhibition activity against cyclooxygenases enzymes (COX). Lemon juice was analyzed by LC-MS/MS (QqTOF), and nine O/C-glycosylated flavonoids were identified: 3 flavanones (eriocitrin, hesperidin and naringin), 1 flavonol (rutin) and 5 flavones (diosmin, luteolin 7-O-rutinose, vitexin 2 "-O-rhamnoside and vicenin-2); by standard and dereplication approaches. The lemon juice also demonstrated strong inhibition of both COX-1 and COX-2 enzymes. Keywords: Menstrual disorders. Prostaglandins. Tahiti lemon juice. Citrus latifolia. Glycosylated flavonoids. Cyclooxygenases 1 and 2. SPE-LC-MS/MS. SRM. LC-MS/MS. Dereplication.
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