Interação da QSOX1b extracelular com a membrana plasmática de células musculares lisas de aorta

Abstract

Resumo: Quiescina/sulfidril oxidase 1 (QSOX1) é uma flavoproteína predominantemente secretada cuja função biológica é pouco compreendida. Por ser extracelular, foi demonstrado que ela pode atuar na organização dos trímeros de laminina, modular a adesão e a migração de células tumorais e de fibroblastos. Nós recentemente mostramos que QSOX1 extracelular (QSOX1b) estimula a proliferação e a migração de células musculares lisas de aorta (VSMC) de rato. A proliferação independe da atividade sulfidril oxidase, diferentemente da migração, que só ocorre na presença da QSOX1b ativa. Neste contexto, nossa hipótese é que a QSOX1b se liga a proteínas na superfície celular e ativa as sinalizações que levam a estes dois processos. Neste trabalho, padronizamos condições experimentais para realizar o crosslink entre a QSOX1b e proteínas da VSMC. Utilizamos formaldeído como um agente estabilizador dos complexos de QSOX1b recombinante com seus possíveis ligantes, permitindo assim a captura da ligação da recombinante selvagem na membrana das VSMC (1% formaldeído, 10 min, 37°C, 1 ?M). Mostramos a presença da QSOX1b recombinante selvagem nos eluatos de extratos de VSMC incubadas com a recombinante e enriquecidos em resina de Ni-NTA, após a separação eletroforética das proteínas. Para avaliar se a QSOX1b recombinante estaria interagindo com alguma proteína de membrana plasmática, o mesmo ensaio foi repetido acrescido de uma etapa de isolamento de fração de membrana celular. Os extratos de fração de membrana foram analisados por western blotting. Os resultados mostraram que o extrato das VSMC incubadas com QSOX1b selvagem, mas não das tratadas com QSOX1b mutada ou não tratadas, continha QSOX1b selvagem, indicando sua ligação a algum componente de membrana. A ligação à superfície celular também foi demonstrada por imunofluorescência indireta. VSMC aderidas ou em suspensão incubadas com QSOX1b recombinante selvagem apresentaram uma imunomarcação positiva com anticorpo anti-QSOX. As imagens adquiridas no microscópio confocal mostraram uma marcação intensa e diferenciada nas bordas e no meio intracelular das células incubadas com 1?M de QSOX1b recombinante selvagem. Esta marcação estava ausente nas células não tratadas com QSOX1b ou tratadas com QSOX1b mutada, sugerindo que a QSOX1b extracelular seja incorporada pela VSMC, por mecanismo ainda incerto. A imunomarcação da QSOX1 estava ausente quando a incubação era feita a 4°C. Em conjunto, estes dados evidenciam que a QSOX1b interage com moléculas da superfície celular, e parece ser internalizada de forma dependente da atividade oxidase. Palavras chave: Quiescina sulfidril oxidase, célula muscular lisa vascular, cross-linking, formaldeído, superfície celular.

Abstract: Quiescin/sulfhydryl oxidase 1 (QSOX1) is a predominantly secreted flavoprotein whose biological function is poorly understood. Due to its extracellular localization, QSOX1b was demonstrated to act in the organization of laminin, to modulate the adhesion and migration of tumor cells and fibroblasts. We recently showed that extracellular QSOX1b stimulates proliferation and migration of rat aortic smooth muscle cells (VSMC). While proliferation is independent of its sulfhydryl oxidase activity, migration occurs only in the presence of active QSOX1. In this context, our hypothesis is that QSOX1b binds to a protein on the cell surface and activates signals that induces these two processes. In this work, we determined the experimental conditions to carry out the crosslink between QSOX1b and proteins from VSMC. We employed formaldehyde as stabilizing agent for the recombinant QSOX1b complexes with their possible ligands, thereby capturing wild-type recombinant binding on the VSMC membrane (1% formaldehyde, 10 min, 37°C, 1 ?M). We showed the presence of recombinant QSOX1b in eluates of VSMC (previously incubated with the QSOX1b) extracts and enriched by Ni-NTA resin, after an electrophoretic separation. To assess if QSOX1b was interacting with some plasma membrane protein, the same assay was done, with the inclusion of a membrane fraction isolation step. The membrane fraction's extracts were analyzed by western blotting. Results showed that the extracts from VSMC incubated with QSOX1b wt, but not with QSOX1b mut or non-treated, presented QSOX1wt, indicating its interaction with some membrane component. QSOX1b binding to cell surface was also demonstrated by indirect immunofluorescence. Adhered or suspended VSMC were incubated with QSOX1b wt and presented a positive immunostaining with anti-QSOX1 antibody. The images, acquired in a confocal microscope, showed an intense intracellular and edge staining in cells incubated with 1 ?M QSOX1b wt. This intracellular staining was absent in cells treated with QSOX1b mut or non-treated cells, suggesting that extracellular QSOX1b is incorporated into VSMC, but by an unknown mechanism. The immunostaining was absent when incubations were done at 4C. Taken together, these data indicate that QSOX1 interacts with molecules present at the cell surface, and seems to be uptaken in an activity-dependent manner. Keywords: Quiescin-sulfhydryl oxidase, vascular smooth muscle cell, cross-linking, formaldehyde, cell surface.