Identificação de ligantes de semaforinas classe 5 através do sistema de duplo-híbrido

Abstract

Resumo: Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os neurônios devem fazer contato correto com alvos específicos que normalmente estão muito afastados. Para isso são necessárias vias sinalizadoras que funcionam como guias no correto direcionamento do cone de crescimento do axônio. Tais vias sinalizadoras são constituídas por moléculas que atraem o axônio para o seu alvo e ao mesmo tempo o repele de vias inapropriadas. Dentre estas moléculas, as semaforinas (Semas) pertencem a uma grande família de proteínas secretadas ou associadas à membrana, envolvidas na navegação axonal, fasciculação, ramificação e formação de sinapses, além da participação na progressão tumoral, angiogênese e diferenciação de linfócitos B. As semaforinas de classe 5 são proteínas transmembrânicas, que contém sete repetições trombospondinas. Dois membros dessa família foram identificados em vertebrados, Sema5A e Sema5B. Na literatura há poucos estudos sobre essa classe específica, especialmente sobre Sema5B. Muitas questões sobre esta molécula permanecem em aberto, tais como sua modulação, expressão celular e papéis específicos. O trabalho em questão teve como objetivo identificar ligantes dos domínios citoplasmáticos das Semaforinas 5A e 5B (Sema_5A e Sema_5B), através do sistema de duplo-híbrido em leveduras. Essa metodologia é amplamente utilizada para detectar interações protéicas in vivo e será de grande importância para o desenvolvimento de projetos futuros e de colaborações. Fragmentos de DNA contendo as seqüências codificadoras dos domínios citoplasmáticos de Sema5A e Sema5B (Sema_5A e Sema_5B) foram amplificados por PCR, digeridos e inseridos no vetor pGILDA. Estas construções (iscas) foram transformadas em bactérias DH5? e os plasmídeos obtidos dos clones positivos foram digeridos e seqüenciados para verificação da construção. Os vetores que apresentaram os insertos corretos foram transformados em leveduras da linhagem RFY 206. Vários protocolos de transformação foram utilizados e, após diversas tentativas e dificuldades contornadas, foi possível obter transformantes com as iscas de interesse. Estas foram então checadas quanto ao potencial de autoativação e expressão. A isca correspondente ao domínio citoplasmático da Sema5B não foi capaz de auto-ativar os genes-repórteres e em ensaio de Western blotting foi possível ver que o domínio em questão estava sendo expresso nas leveduras. Já a isca referente à Sema5A mostrou ser capaz de auto-ativar os genes-repórteres usados no sistema. Dessa forma, apenas a isca Sema5B foi utilizada para varredura de uma biblioteca de cDNA de epitélio olfatório (disponível em nosso laboratório). Nessa varredura foram obtidos 11 clones positivos para interação. Após o sequenciamento dos insertos, 3 candidatos apresentaram insertos com a correta fase aberta de leitura para proteínas que podem ser reais parceiros moleculares de Sema5B: Cript, Scramblase 2 e Trappc6a. Algumas publicações a respeito dessas proteínas mostram que pode haver interações biologicamente relevantes, mostrando que a técnica pode produzir bons resultados. Estes resultados preliminares já indicam um novo caminho a ser tomado. Plavras-chave: Semaforina, Neurogênese, Sistema de duplo híbrido, Biologia molecular.

Abstract: In the developing neuron system, the correct axon guidance is essential for linking the axons to their targets. Many proteins are involved in the signaling pathway of the growth cones. Some signal proteins attract the growth cone to become an axon while others proteins repel it from the wrong direction. The Semaphorins belongs to a large family of secreted and membrane associated proteins, which are involved on axon navigation, fasciculation and synaptic formation, besides the role on tumor progression, angiogenesis and B-lymphocyte differentiation. Class 5 Semaphorin are transmembrane proteins, containing seven thrombospondin repetitions. Two members of this family are found on invertebrates, Sema5A and Sema5B. There are few studies on the literature regarding Sema5A and 5B. Questions about modulation, cellular expression and reverse signaling are yet to be answered. This work has the objective of identify putative ligands for the cytoplasmatic domains of Sema5A and Sema5B through employment of Yeast Two- Hybrid System (Y2H). The Yeast Two-hybrid System is a powerful tool for identify proteins from an expression library that interact whit a protein of your interest. Coding DNA for the cytoplasmatic domains of Sema5A and Sema5B (Sema_5A e Sema_5B) where amplified, digested, and cloned on pGILDA plasmids. Mini and maxi preps of these plasmids (baits) where made on DH5? and sequenced to verify the correct assembly. The bait plasmids were transformed on RFY 206 yeasts. The Sema5B construction on pGILDA, transformed on RFY 206 did not induce autoactivation, while the Sema5A did, as of these result, the constructed Sema5A expression vector are not able to be used on the Y2H system. Sema5B bait was used to screen an expression library from olfactory epithelium. 11 interaction positive clones were identified. Tree proteins, with the correct ORF (open reading frame), where identified: Cript, Scramblase 2 e Trappc6a. Some publication indicated a viable biological interaction between these proteins and Sema5B. Key-words: Semaphorin, Neurogenesis, Yeast two hybrid, Y2H, Molecular biology.