Produçao de bioferramentas para o estudo das proteínas semaforina 5B e QSOX

Abstract

O objetivo deste trabalho foi produzir reagentes específicos para estudar as proteínas Semaforina 5B e QSOX. As semaforinas constituem uma grande família de proteínas solúveis, transmembrânicas ou ancoradas à membrana celular; são ubíquas e descritas em vários sistemas biológicos. Até o momento já foram descritas pelo menos 20 Semas as quais encontram-se enquadradas em 8 classes diferentes. Entre as semaforinas de vertebrados, Semas classe 5 são constituídas por proteínas transmembrânicas que possuem no domínio extracelular 7 repetições do tipo TSP em adição ao domínio Sema. Contudo, os papéis específicos desempenhados pelos membros pertencentes às Semas classe 5 são pouco conhecidos, em especial Sema5B. QSOX são flavoenzimas que catalisam a oxidação de grupos sulfidrila a dissulfetos com a redução do oxigênio molecular a peróxido de hidrogênio, e são compostos de 2 domínios distintos: um domínio N-terminal Trx e um domínio próximo à região C-terminal homóloga à ERV1p de levedura. Estas oxidases são encontradas em uma ampla variedade de tecidos em várias espécies, e parecem desempenhar papéis importantes no dobramento protéico oxidativo. No entanto, desconhece-se as reais funções desempenhadas por Sema5B e QSOX e a regulação da expressão destas proteínas. Na tentativa de se elucidar algumas das funções desempenhadas por estas proteínas, produziu-se ferramentas que podem auxiliar no estudo de Sema5B e QSOX. Tais ferramentas incluíram a expressão heteróloga destas moléculas, a produção de anticorpos policlonais contra estes antígenos e o emprego destes anticorpos em ensaios bioquímicos e de localização tecidual. Demonstrou-se com essas bioferramentas a presença de QSOX no soro fetal bovino, e a expressão de Sema5B no S.N. que possivelmente encontra-se na forma de zimogênio in vivo. Adicionalmente ensaios de imunohistoquímica e novas subclonagens de Sema5B estão em andamento

The aim of this work was to produce specific reagents to study Semaphorin 5B and QSOX proteins. Semaphorins constitute a large family of soluble and membrane-bound proteins originally identified in several biological systems. To date more than 20 Sema members have been identified and split into 8 individual classes. Amongst the vertebrate semaphorins class 5 Sema is constituted by transmembrane proteins that have an unusual pairing of domains; their extracellular domain contains 7 thrombospondin repeats in addition to the Sema domain. Although many reports have addressed the function of several semaphorins there are few data concerning to semaphoring class 5 biological functions, especially Sema5B. QSOXs are flavoenzymes that catalyze the oxidation of dithiols to disulfides with the reduction of oxygen to hydrogen peroxide, and are composed of two distinct domains, an N-terminal Trx domain and a C-terminal catalytically active yeast ERV1 domain. These oxidases are found in a large variety of tissues in many species, and they are likely to play an important role in oxidative protein folding. In fact, very little is known about the functions that these oxidases have in the cell and about the regulation of the QSOXs. In order to investigate possible roles and regulation of Sema5B and QSOXs, we expressed them as recombinant proteins, raised polyclonal antibodies in rabbits and carried out some biochemical assays. We demonstrated that QSOX is present in fetal bovine serum, and the expression of Sema5B in C.N.S. – apparently this protein is a zymogen. Additionally immunohistochemical assays and other subcloning of distincts domains of Sema5B are being carried out.