Estudo dos efeitos citotóxicos do veneno de Loxosceles intermedia e de toxinas recombinantes sobre células subendoteliais

Abstract

Dentre os quadros clínicos produzidos por acidentes que envolvem animais peçonhentos, aqueles causados pelos aracnídeos são os de maior importância médica. Aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas popularmente como aranhas marrom têm se tornado um problema de saúde pública no Estado do Paraná, pois as ocorrências notificadas têm aumentado de forma alarmante. O veneno das aranhas do gênero Loxosceles provoca o loxoscelismo que pode gerar até dois tipos de quadros clínicos: cutâneos ou dermonecróticos e cutâneo-viscerais ou sistêmicos. O quadro cutâneo caracteriza-se por uma lesão dermonecrótica com espalhamento gravitacional no local da picada e o quadro cutâneo-visceral ou sistêmico se caracteriza por distúrbios hematológicos, alterações nas paredes dos vasos e disfunção renal, sendo esta última a responsável pela morte das vítimas. Desta forma, esta dissertação teve por objetivo avaliar os efeitos citotóxicos do veneno de aranhas L. intermedia e de toxinas recombinantes sobre células subendoteliais (células musculares lisas, provenientes da túnica média de aorta de coelho) visando uma melhor compreensão da ação do veneno sobre as alterações nas paredes dos vasos. Os resultados apontaram claramente que o veneno de L. intermedia provocou alterações na morfologia das células subendoteliais. Ensaios de citoquímica fluorescente mostraram que o veneno foi capaz de provocar reorganização dos filamentos de actina. Outras alterações como a diminuição da viabilidade e da proliferação foram avaliadas pelos métodos de exclusão com Azul de Trypan e MTT, respectivamente. Ensaios de Imunofluorescência e de Citometria de Fluxo apontaram que o veneno se liga diretamente a superfície das células. Ensaios empregando a toxina recombinante LiRecDT1 na linhagem subendotelial demonstraram que esta toxina não foi capaz de causar alterações morfológicas. Anticorpos que reconhecem LiRecMP1 foram capazes de inibir a ação de metaloproteases presentes no veneno de L. intermedia, impedindo que ocorressem alterações morfológicas nas células subendoteliais, degradação de fibronectina (eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE) e aumento da permeabilidade vascular, detectada em camundongos pelo corante vital Azul de Evans. Os resultados obtidos permitiram sugerir que metaloproteases da família das astacinas presentes no veneno, análogas a LiRecMP1 são responsáveis por muitos dos danos causados pelo veneno de L. intermedia em células subendoteliais, provavelmente por degradar moléculas de fibronectina (importante molécula da matriz extracelular produzida por células subendoteliais) além de poderem ser fatores de espalhamento de outras toxinas do veneno na matriz extracelular contribuindo para o aumento da permeabilidade nos vasos sanguíneos. A ação das metaloproteases presentes no veneno de L. intermedia na matriz extracelular de células subendotelias e de outras células que produzam fibronectina poderão futuramente ser melhor investigadas, permitindo uma melhor compreensão destas moléculas no loxoscelismo

Accidents caused by brown spiders (Loxosceles Genus) are normally associated with necrotic lesions of skin with gravitational spreading and systemic manifestations such as thrombocytopenia, hemolysis and renal disturbances. The mechanism by which the venom exerts these noxious effects is currently under investigation. Brown spider venom has a complex composition containing many different toxins, of which metalloproteases have been described in many different species of this Genus. These toxins may produce degradation of extracellular matrix constituents such as fibronectin, fibrinogen, entactin and endothelial heparan sulfate proteoglycan and putatively may act as spreading factor for other venom toxins. Here, we studied the L. intermedia venom effect upon RI sub endothelial cells. The venom was cytotoxic upon cells by inducing morphologic alterations and causing disturbs in cell adhesion to culture substrate. Employing a cDNA library of L. intermedia venom gland, we cloned and expressed a recombinant metalloprotease that we named LiRecMP1 (900bp cDNA) that encodes for a signal peptide and a pro-protein. Nucleotide, deduced amino acid, phylogenetic analysis and computer modeling revealed a structural relationship for this toxin with astacin family of metalloproteases. A recombinant molecule expressed as N-terminal His-tag fusion protein in Escherichia coli, was purified to homogeneity from cell lysates by Ni2+-chromatography, resulting in a protein of 30kDa. Purified recombinant toxin was used to produce a polyclonal antiserum from which were purified hyperimmune antibodies that showed reactivity to LiRecMP1 and cross-reactivity to a native venom protein at 30kDa. The presence and involvement of this astacin-like metalloproteases on the noxious activity of the venom as a spreading factor was strengthened by the inhibitory activity of hyperimmune antibodies against LiRecMP1 upon venom-dependent desadhesive cell effect, fibronectinolysis and venom-dependent increase of vascular permeability. These molecular biology and functional studies suggest for the fist time the existence of an astacin-like toxin in an animal venom secretion and make this recombinant toxin suitable for future structural and functional studies about venom and astacin family.