Obtenção e caracterização funcional de toxinas recombinantes pertencente à família das notinas presente do veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)

Abstract

Resumo: As aranhas-marrons são aracnídeos peçonhentos que pertencem ao gênero Loxosceles. No Estado do Paraná, a espécie Loxosceles intermedia é a mais frequente e, devido ao grande número de acidentes que causa, possui importância médica. O veneno dessas aranhas é uma mistura cristalina de proteínas e peptídeos de baixa massa molecular (5-40 kDa), sendo que as enzimas são as mais estudadas, tais como as fosfolipases-D, metaloproteases e hialuronidases. O transcriptoma da glândula de veneno confirmou a existência de diferentes classes de toxinas e revelou a predominância de transcritos para diversas toxinas potencialmente inseticidas (56%) pertencentes a família das notinas, as quais foram pouco estudadas até o momento. Peptídeos inseticidas já foram descritos para o veneno de L. intermedia onde três peptídeos, LiTx 1, LiTx 2 e LiTx 3, foram purificados do veneno e mostraram atividade inseticida sobre larvas de mariposa, Spodoptera frugiperda. O presente trabalho visou o estudo de toxinas inseticidas da família das notinas presentes no veneno de L. intermedia. A toxina do tipo notina que foi foco inicial do trabalho, apresenta 52% de identidade aminoacídica com uma toxina inibidora de canal de sódio de insetos encontrada na aranha Macrothele gigas. A partir da biblioteca de cDNA do transcriptoma, a U2-SCRTX-Lit2, foi clonada e expressa heterologamente em Escherichia coli e Pichia pastoris. Mesmo a toxina sendo expressa em condições solúveis ela não apresentou atividade biológica quando testada. Foram também expressas em E. coli e testadas outras três toxinas (U2-SCRTX-Lit1b, U1-SCRTX-Lit1a e U1-SCRTX-Lit1b) potencialmente inseticidas presentes no veneno de L. intermedia, essas foram purificadas e tiveram sua atividade biológica testada em moscas. Todas as três toxinas apresentaram atividade inseticida e baixa atividade sobre canais iônicos de mamíferos. Também foi possível determinar a estrutura da U2-SCRTX-Lit1b por RMN, onde obteve-se a primeira estrutura resolvida de toxina da família ICK com cinco pontes dissulfeto. Os dados gerados reforçam a ideia de aplicação biotecnológica de toxinas de aranha. A caracterização de toxinas inseticidas presentes no veneno de L. intermedia contribui com a expansão do conhecimento sobre o veneno de aranha marrom e além disso com a ideia de desenvolver um agente bioinseticida, que pode apresentar baixa toxicidade para mamíferos.

Abstract: Brown spiders are venomous animals which belong to Loxosceles genus. At Paraná state, Loxosceles intermedia is the most abundant specie, and it is medically important due to great number of envenomation it causes. L. intermedia venom is a cristal clear mixture of proteins and peptides of low molecular weight (5-40 kDa), and the most studied ones are the enzimes, as phospholipases-D, metalloprateases and hyaluronidases. The venom gland transcriptome confirmed the existence of several toxins classes where the predominant transcripts were for potentially insecticidal toxins (56%) belonging to knottin family, under studied up to date. Insecticidal peptides already were described for L. intermedia venom where three peptides, LiTx 1, LiTx 2 and LiTx 3, were purified from whole venom and show insecticidal activity against moth larvae (Spodoptera litutra). Our aim was the insecticidal toxins from knottin family from L. intermedia venom. A knottin toxin was the first subject of our work, it has 52% of amino acidic identity with a sodium channel inhibitor toxin from Macrothele gigas spider. From a cDNA library the U2-SCRTX-Lit2 were cloned and recombinant expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris. We were able to express it in a soluble way, but the toxin didn't show biological activity when tested. We also express in E. coli and test three other insecticidal toxins (U2-SCRTX-Lit1b, U1-SCRTX-Lit1a e U1-SCRTX-Lit1b) from L. intermedia venom, with activity over sheep blowflies. All three toxins are insecticidal and has low activity over mammal ion channels. We also were able to solve the molecular structure of U2-SCRTX-Lit1b by NMR spectroscopy, and it's the first structure with five disulphide bonds from knottin family solved. The data reinforce the biotechnological application for spider toxins. The characterization of insecticidal toxins from L. intermedia venom contributes to increase the knowledge about brown spider venom and with the aim of develop a new bioinsecticide agent that can have low toxicity for mammals.