Aplicação do método de Monte Carlo para simular a hidrólise de oligômeros de ácido D-galacturônico por uma endopoligalacturonase

Abstract

Resumo: A hidrólise da pectina por misturas de enzimas pectinoliticas é uma etapa importante em biorrefinarias de resíduos cítricos. No entanto, apesar da hidrólise enzimática da pectina ter sido estudada por muitos anos, há relativamente poucos modelos matemáticos que descrevam a cinética deste processo. O desenvolvimento de modelos cinéticos com base nas equações diferenciais é bastante difícil devido à estrutura complexa da pectina e a mistura complexa de enzimas pectinoliticas envolvidas na sua degradação. Um modelo capaz de descrever a degradação enzimática de substratos pécticos será uma importante ferramenta para o projeto de um processo de hidrólise de pectina em uma biorrefinaria de polpa cítrica. Com isso o objetivo do presente trabalho foi de iniciar o desenvolvimento de um modelo de Monte Carlo com um sistema mais simples, ou seja, um modelo com uma enzima trabalhando com oligômeros de ácido D-galacturônico de cadeia linear. Os dados detalhados da hidrólise dos oligômeros pela enzima endopoligalacturonase foram obtidos da literatura (Bonnin et al., 2001, Study of the mode of action of endopolygalacturonase from Fusarium moniliforme, Biochimica et Biophysica Acta 1526, 301-309). A partir destes dados foi implementado um modelo que descreve as preferências de uma enzima endopoligalacturonase do Fusarium moniliforme durante a hidrólise dos oligômeros de ácido D-galacturônico com grau de polimerização (GP) entre 2 a 7, estes substratos foram referidos de acordo com o seu GP, como monômeros (S = GalA), dímeros (S = GalA2), trímeros (S = GalA3), tetrâmeros (S = GalA 4), pentâmeros (S = GalA5), hexâmeros (S = GalA6) e heptâmeros (S = GalA7) de ácido D-galacturônico, onde o "S" representa substrato. Os valores dos parâmetros relativos as constantes de especificidade, foram determinados usando a função "fminsearch" do MATLAB, que utiliza o método simplex para minimização de uma função objetivo. Neste caso particular, a sub-rotina que foi usada para calcular a função objetivo continha um programa que realizou cinco simulações Monte Carlo. A grande vantagem da análise realizada, é que ela permite atribuir as preferências para as várias reações que são possíveis para cada oligômero, isto é, ao contrario de Bonnin et al. (2001) que atribuiu uma constante de especificidade para cada oligômero. Ao se determinar uma constante de especificidade para cada reação de encontro da enzima com o substrato, é possível identificar qual é o tipo de substrato que a enzima prefere, bem como o tipo de ligação que a enzima prefere para fazer a reação de hidrólise, ou seja, com a definição de mais de uma constante de especificidade foi possível perceber que a enzima prefere o centro da molécula de substrato. Com este estudo foi possível identificar que a aplicação do modelo desenvolvido é viável, pois o ajuste foi realizado como todos os dados simultaneamente, e seria interessante continuar o estudo para estender o modelo para descrever situações mais complexas envolvendo substratos ramificados e misturas de enzimas com diferentes ações. Uma vez desenvolvido o modelo final será uma ferramenta útil na concepção e otimização de biorreatores enzimáticos para hidrólise de pectina em ácido D-galacturônico.

Abstract: The hydrolysis of the pectin mixtures of pectinolytic enzymes is an important step in biorefinery citrus waste. However, despite pectin enzymatic hydrolysis has been studied for many years, there are relatively few mathematical models describing the process kinetics. The development of kinetic models based on differential equations is very difficult due to the complex structure of pectin and the mixture of pectinolytic complex enzymes involved in its degradation. Modelling the enzymatic degradation of pectic substrates will be important for the design of a pectin hydrolysis process in citrus pulp biorefineries. Therefore, the objective of this study is to start the development of a Monte Carlo model with a simpler system, in other words, a model with an enzyme working with acid oligomers D-galacturonic straight chain. The detailed data of the oligomers by the hydrolysis of endopolygalacturonase enzyme were obtained from the literature (Bonnin et al., 2001, Study of the mode of action of endopolygalacturonase from Fusarium moniliforme, Biochimica et Biophysica Acta 1526, 301-309). From these data, a model is implemented which describes the preferences of a Fusarium moniliforme endopolygalacturonase enzyme for the hydrolysis of oligomers of D-galacturonic acid with a degree of polymerisation (DP) between 2 and 7, these substrates were listed according to their GP, as monomers (S = GalA), dimers (S = GalA2), trimers (S = GalA3), tetramers (S = GalA4), pentamers (S = GalA5), hexamers (S = GalA6) and heptamers (S = GalA7) of D-galacturonic acid, where "S" represents a substrate. The parameter values for the constants of specificity were determined using the tool "fminsearch" MATLAB, which uses the simplex method to minimize an objective function. In this particular case, the subroutine that was used to calculate the objective function contained a program that held five Monte Carlo simulations. The great advantage of the analysis that was made is that it allows you to assign preferences for the various reactions that are possible for each oligomer, that is, as opposed to Bonnin et al. (2001) attributed a specificity constant for each oligomer. When determining a specificity constant for each enzyme against reaction with the substrate, it is possible to identify what kind of substrate the enzyme prefers, as well as the type of connection that the enzyme prefers to make the hydrolysis reaction, or that is, the definition of more than one specificity constant was revealed that the enzyme prefers the center of the substrate molecule. In this study it was identified that the application of the developed model is viable, because the adjustment is performed with all data simultaneously and continue the study would be interesting to extend the model to describe situations involving more complex branched substrates and enzyme mixtures with different actions. Once developed the final model will be a useful tool in the design and optimization for bioreactors enzymatic hydrolysis of pectin as D-galacturonic acid. Keywords: Monte Carlo method. Pectin. D-galacturonic acid. Endopolygalacturonase. Specificity constant.