Desenvolvimento e validação de métodos para a quantificação de fármacos antimaláricos utilizando IVM-PLS e CLAE-EM/EM

Abstract

Resumo: Mundialmente reconhecida como um grave problema de saúde pública, a malária acomete principalmente países das regiões tropicais do mundo. Atualmente a terapia combinada à base de artesunato (ARS) e mefloquina (MFQ) é considerada o tratamento de primeira escolha para malária por P. falciparum, sendo recomendada desde 2002 pela OMS e 2006 pelo Ministério da Saúde. Dentre os vários obstáculos ao tratamento, um que tem contribuído para o desenvolvimento de cepas resistentes é a incidência do uso de medicamentos de má qualidade. Apesar dessa terapia ser recomendada desde 2002, compêndios oficiais como farmacopeias não descrevem métodos de análise para essa associação e a literatura cientifica ainda é muito escassa de publicações com métodos de referência em análises de controle de qualidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar métodos analíticos por CLAE-EM/EM e por espectroscopia no infravermelho médio associado à calibração multivariada (IVM-PLS), capazes de quantificar simultaneamente a associação dos fármacos ARS e MFQ. A primeira técnica é sensível e seletiva, ideal para quantificação simultânea dos fármacos, já a segunda é uma técnica simples, rápida, sem uso de solventes orgânicos e de baixo custo. O método por CLAE-EM/EM foi operado com interface electrospray, no modo positivo de ionização através de um detector do tipo quadrupolo. A cromatografia foi realizada em coluna XBridge C18 (2,1x50 mm; 5 ?m), a fase móvel consistiu em água:acetonitrila:metanol:ácido fórmico (30:35:35:0,1 v/v/v/v), fluxo de 0,35 mL.min-1 em modo de eluição isocrática. A validação foi realizada de acordo com legislação vigente (ANVISA), mostrando-se seletivo, linear (r>0,99), preciso (DPR<5%) e exato (recuperação entre 95 e 105%). O método por IVM-PLS foi operado no modo de refletância difusa, na região de 400 a 4000 cm-1, com uma resolução de 4 cm-1, 32 scans e temperatura e umidade controladas. Na construção do modelo foram utilizados planejamentos experimentais para desenvolver e validar o método, os dados foram tratados matematicamente no software PLS-Toolbox 3.0 que opera em ambiente Matlab 7.01. O melhor modelo foi por regressão por mínimos quadrados parciais - PLS com a combinação dos pré-processamentos: 1º derivada com alisamento Savitzky-Golay, seguido de correção do espalhamento de luz e dados centrados na média. A validação cruzada foi feita utilizando o método leave-one-out. O modelo foi construído com o uso de 3 variáveis latentes, proporcionando RMSEP inferior a 1,93 mg.100 mg-1 para os dois analitos. O método foi validado de acordo com os respectivos regulamentos nacionais (ANVISA) e internacionais (ASTM E1655-05) através da estimativa de figuras de mérito, tais como exatidão, precisão, linearidade, sensibilidade analítica, seletividade, bias e desvio residual da predição. Na avaliação das amostras comerciais os métodos desenvolvidos forneceram resultados estatisticamente equivalentes, apresentando valores de p superiores a 0,05 e valores de t calculados inferiores aos valores de t crítico (nível confiança: 95%). Os métodos desenvolvidos se mostraram adequados para o controle de qualidade desses fármacos, podendo ser aplicados na rotina de laboratórios que prestam serviços de controle de qualidade, bem como na indústria no controle de processo, além de análises fiscais. Palavras-chave: Artesunato, Mefloquina, CLAE-EM/EM, Infravermelho Médio, Calibração Multivariada, PLS, Validação Analítica.

Abstract: Widely recognized as a serious public health problem, malaria affects mainly countries in tropical regions of the world. Currently, the combination therapy of artesunate (ARS) and mefloquine (MFQ) is the first choice treatment for P. falciparum malaria, and it is recommended by the World Health Organization since 2002 and by Brasilian Ministry of Health since 2006. Among the treatment barriers, one that has contributed to the development of drug-resistant strains is the incidence of the use of low quality drugs. Although this therapy is recommended since 2002, there is non-pharmacopoeic method devoted to this drug combination and studies about quality control methods are still scarce. For this reason, the present work was devoted to the development and validation of methods for simultaneous determination of ARS and MFQ by LC-MS/MS and by infrared spectroscopy with multivariate calibration (PLS-MIR). The first technique is selective and sensible, ideal for simultaneous determination of the analytes and the second one is simple, rapid, solvent free, and low cost. The analyses by LC-MS/MS were carried out with a triple quadrupole spectrometer equipped with an electrospray source, operated in positive ion mode. The chromatography used a XBridge column C18 (2,1x50 mm; 5 ?m), mobile phase of water:acetonitrile:methanol:formic acid (30:35:35:0,1 v/v/v/v), at flow rate of 350 ?L.min-1, and isocratic elution. Validation was performed according to the current legislation (ANVISA), the method was selective, linear (r>0,99), precise (RSD<5%) and accurate (recovery ranging from 95-105%). PLS-MIR method was carried out by diffuse reflectance mode and the spectra were recorded from 4000 to 400 cm-1 as the average of 32 scans, with a resolution of 4 cm-1 under controlled humidity and temperature. Experimental design was used for model development and validation, data were handled using PLS-Toolbox 3.0 software operated in MATLAB 7.01 environment. The best model was obtained using partial least squares - PLS2 and preprocessed by 1st Derivative and Savitzky-Golay smoothing plus multiplicative scatter correction (MSC) followed by mean center. The cross validation was performed using leave-one-out method. The model was developed using 3 latent variables, providing RMSEP<1.93 mg.100 mg-1 for both analytes. The method was validated according to current legislation (ANVISA) and international recommendations (ASTM E1655-05) through the estimate of figures of merit such as accuracy, precision, linearity, analytical sensitivity, selectivity, bias, and residual prediction deviation (RDP). When analyzing commercial samples, LC-MS/MS and PLS-MIR methods provided statistically equivalent results, with p-values greater than 0.05 and calculated t values less than critical t values (confidence interval: 95%). The developed methods were suitable for quality control of these drugs and can be applied in laboratorial quality control routine, in-process control, besides fiscal analysis. Key words: Artesunate, Mefloquine, LC-MS/MS, Medium Infrared, Multivariate calibration, PLS, Analytical Validation.