O papel do Gene Reck como marcador tumoral de melanoma : função e regulação dos transcritos RECKB e RECKA

Abstract

Resumo: RECK (reversion-inducing cysteine rich protein with Kazal motifs) é descrito como um supressor tumoral, e a manutenção de níveis elevados correlaciona com um melhor prognóstico para pacientes portadores de diversos tipos de câncer. O papel de supressor tumoral é associado à inibição de metaloproteases de matriz extracelular (MMPs), envolvidas em processos como remodelamento da matriz, invasividade e angiogênese em tumores. Apesar do forte envolvimento de MMPs e de seus inibidores solúveis, TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteases), no estabelecimento e na progressão de melanomas, o papel do gene RECK ainda é desconhecido neste tipo de tumor. Além disto, novos transcritos do gene RECK, resultantes de splicing alternativo foram recentemente identificados. Suas funções, porém, ainda não foram elucidadas. Neste trabalho analisamos dados de microarranjos de painéis de amostras clínicas de melanoma e demonstramos que o transcrito canônico do gene RECK, chamado RECKA, e TIMP3 têm sua expressão silenciada durante a transformação do melanoma, enquanto MT1MMP e TIMP2 são regulados positivamente. Também mostramos que amostras clínicas com expressão de RECKA acima da média apresentam menor expressão de MT1MMP e TIMP2, além de maior expressão de TIMP3 que amostras com níveis de RECKA abaixo da média. Além disto, a superexpressão do transcrito alternativo do gene RECK, RECKB, na linhagem de melanoma metastático 1205Lu, promove o aumento da transcrição de MMP9 e a ativação pró-MMP-9 in vitro, antagonizando RECKA. A superexpressão de RECKB promove, ainda, o aumento de expressão de MT1MMP e TIMP2, enquanto a expressão de TIMP3 é reduzida, induzindo, assim, um perfil de expressão análogo ao observado em amostras clínicas com expressão de RECKA abaixo da média. Por fim, as células da linhagem 1205Lu foram incubadas com inibidores farmacológicos de diferentes vias de sinalização envolvidas na tumorigênese, para demonstrar que a razão RECKB/RECKA é regulada pelas vias de MAPK e PI3K. A análise da expressão de RECKA, de RECKB e de RECKD em dados de RNA-Seq depositados em bancos de dados de livre acesso revela que o proto-oncogene regulador de splicing alternativo SRSF1 altera a razão RECKB/RECKA sendo, portanto, um candidato à mediar a regulação desta razão pelas vias de sinalização oncogênicas testadas. Estes dados sugerem que RECKB e RECKA possuem papéis opostos em melanoma, o que implicaria em um papel dual para o gene RECK. Palavras-chave: Reversion-Inducing Cysteine-Rich Protein With Kazal Motifs, Melanoma, Câncer, Expressão Gênica, Metaloproteases de Matriz, Inibidores Teciduais de Metaloproteases, Splicing Alternativo, Oncogenes

Abstract: RECK (reversion-inducing cysteine rich protein with Kazal motifs) is known as a tumor suppressor gene, and higher RECK levels correlate with a better prognosis for patients of several types of cancer. This tumor suppressor role is associated with the inhibition of matrix metalloproteinases, which are involved in processes like extracellular matrix degradation, cell invasiveness and tumor angiogenesis. Despite the wide implication of MMPs and their soluble inhibitors, TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases), in melanoma establishment and progression, the role of the RECK gene in this tumor type is yet to be studied. In addition, novel alternatively spliced transcripts of the RECK gene were recently identified, but their roles are still unknown. Here, we analyzed microarray datasets of clinical melanoma samples to demonstrate that the canonical RECK transcript, namely RECKA, and TIMP3 are downregulated during the melanoma onset, whereas MT1MMP and TIMP2 levels increase. We also show that clinical samples with above-average RECKA expression displayed lower MT1MMP and TIMP2 and higher TIMP3 levels than the group with below-average RECKA levels. Moreover, the overexpression of RECKB, a novel alternatively spliced transcript of the RECK gene, in the metastasis-derived cell line 1205Lu, upregulates MMP9 transcription and enhances pro-MMP-9 activation in vitro, antagonizing RECKA, a MMP-9 inhibitor. Overexpressed RECKB also upregulates MT1MMP and TIMP2 genes, and downregulates TIMP3, inducing an expression profile similar to that observed in low RECKA groups. We also incubated 1205Lu cells with pharmacological inhibitors of different signaling pathways associated with tumorigenesis to show that RECKB/RECKA ratio is regulated by MAPK and PI3K signaling. RNA-Seq analysis of RECKA, RECKB and RECKD expression reveals that the the proto-oncogene splicing regulator SRSF1 increases RECKB/RECKA ratio. Thus, SRSF1 is a candidate mediator between oncogenic pathway signaling and the splicing ratio regulation observed. These data suggest that RECKB and RECKA possess opposite roles in the melanoma pathogenesis, implicating in dual roles for the RECK gene. Keywords: Reversion-Inducing Cysteine-Rich Protein with Kazal Motifs, Melanoma, Cancer, Gene Expression, Matrix Metalloproteinases, Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, Alternative Splicing, Oncogenes