Avaliação da atividade de fosfolipase-D recombinante do veneno da aranha marrom(Loxosceles intermedia) sobre a proliferação, influxo de cálcio e metabolismo de fosfolipídios em células tumorais

Abstract

Resumo: As fosfolipases são uma família de enzimas encontradas em várias fontes biológicas incluindo os organismos procarióticos e eucarióticos. As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas popularmente como aranhas marrons, são eficazes em produzir em seus venenos uma grande proporção de fosfolipases-D. No veneno destas aranhas, estas enzimas estão relacionadas à dermonecrose, desregulação da resposta inflamatória, hemólise, nefrotoxicidade e agregação plaquetária. As fosfolipases-D catalizam a hidrólise de diferentes fosfolipídios gerando ácido fosfatídico, ou ácido lisofosfatídico, ou ceramida-1-fosfato, importantes mediadores nos eventos de sinalizações celulares. Alterações no padrão de expressão, atividade destas moléculas ou receptores para seus produtos tem sido relacionados com o desenvolvimento de muitos tumores. Desta forma, neste trabalho foi observado o efeito de uma fosfolipase-D exógena recombinante da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia (LiRecDT1) sobre as células das linhagens de melanoma murino B16-F10 e B16-F1. Por meio de experimentos de imunoblotting em duas dimensões com anticorpo contra a fosfolipase-D recombinante LiRecDT1 foi observada reatividade imunológica cruzada para pelo menos 25 spots no veneno bruto de L. intermedia, indicando alto nível de expressão para diferentes isoformas de fosfolipase-D. Experimentos de cinética de degradação de lipídios mostraram que esta toxina degrada de maneira tempo dependente tanto esfingomileina, gerando ceramida-1-fosfato e colina, quanto lisofosfatidilcolina, gerando ácido lisofosfatídico e colina e mostram menor atividade contra fosfatidilcolina. Através de experimentos de imunofluorescência com anticorpos contra LiRecDT1 e usando a toxina recombinante de fusão LiRecDT1-GFP foi observado a ligação direta de LiRecDT1 na membrana de células B16-F10. Também foi observado que a toxina recombinante LiRecDT1 tem acesso e degrada fosfolipídios das membranas das células B16-F10, observado em experimentos com extratos de membranas obtidos com detergente ou Ghosts de membrana pela geração de colina. Usando o Fluo-4 AM, um fluoróforo permeante sensível ao cálcio, foi possível observar que o tratamento das células B16-F10 e B16-F1 com a toxina LiRecDT1 induziu um aumento da concentração de cálcio no citoplasma. Em células B16-F10 também foram avaliadas a viabilidade e a morfologia após o tratamento com a fosfolipase-D recombinante e os resultados mostraram que não houve alterações sugerindo que a entrada de cálcio não foi decorrente a danos causados à membrana das células. Baseado no que é conhecido sobre a atividade de fosfolipases-D endógenas como indutores da proliferação celular e no fato de que LiRecDT1 se liga a superfície de células B16-F10 hidrolisando fosfolipídios e gerando lipídios bioativos, foi utilizada a toxina LiRecDT1 como uma fonte exógena de fosfolipase-D em células B16-F10. O tratamento destas células com a fosfolipase-D recombinante de aranha marrom foi efetivo no aumento da sua proliferação e de maneira tempo e concentração dependentes, especialmente na presença de esfingomielina sintética no meio. Estes resultados sugerem que a fosfolipase-D de aranha marrom pode ser usada como uma ferramenta bioativa para protocolos experimentais em biologia celular.

Abstract: Phospholipases are a family of enzymes found in several biological sources including prokaryotic and higher organisms. The spiders of genus Loxosceles, popularly known as brown spiders, are effective in producing in their venom a great proportion of phospholipases-D. In the venom of brown spiders, these enzymes are related to dermonecrosis, dysregulated inflammatory responses, hemolysis, nephrotoxicity and platelet aggregation. The phospholipase-D catalyze the hydrolysis of different phospholipids generating phosphatidic acid or lysophosphatidic acid or ceramide-1- phosphate, important mediators in cellular signaling events. Changes in expression and activity of these molecules or receptors for their products have been related with several kinds of cancer. Thus, in this work was observed the effect of exogenous recombinant phospholipase-D (LiRecDT1) from brown spider (Loxosceles intermedia) venom gland on cells of murine melanoma B16-F10 and B16-F1. Through two-dimensional immunoblotting, with antibody against recombinant phospholipase-D (LiRecDT1) was observed immunological cross-reactivity for at least 25 spots in crude L. intermedia venom, indicating high expression levels for different isoforms of phospholipase-D. Phospholipid degrading kinetic experiments showed that this toxin mainly degrades synthetic sphingomyelin in a time-dependent manner, generating ceramide-1-phosphate plus choline, as well as lysophosphatidylcholine, generating lysophosphatidic acid plus choline, but exhibits little activity against phosphatidylcholine. Through immunofluorescence assays with antibodies against LiRecDT1 and using a recombinant GFP- LiRecDT1 fusion protein, was observed direct binding of LiRecDT1 to the membrane of B16-F10 cells. Addicionally, was shown that recombinant phospholipase-D LiRecDT1 degrades phospholipids in detergent extracts and from ghosts of B16-F10 cells, generating choline, indicating that the enzyme can access, modulates and has activity against membrane phospholipids. Using Fluo-4, a calcium-sensitive fluorophore, was observed that treatment of B16-F1 and B16-F10 cells with phospholipase-D, induced an increase of calcium concentration in the cytoplasm of cells. In B16-F10 cells, morphology and viability were also evaluated after treatment with the recombinant phospholipase-D and the results showed no changes suggesting that calcium influx was not caused by damage of cell membrane. Based on the known endogenous activity of phospholipase-D as an inducer of cell proliferation and on the fact that LiRecDT1 binds to B16-F10 cell surface, hydrolyzing phospholipids and generating bioactive lipids, we used LiRecDT1 toxin as an exogenous source of phospholipase-D in B16- F10 cells. Treatment of the cells with recombinant phospholipase-D (LiRecDT1) was effective in increasing their proliferation in a time- and concentration dependent manner, especially in the presence of synthetic sphingomyelin in the medium. The results suggested that phospholipase-D from brown spider can be used as a bioactive tool for experimental protocols in cell biology.