Identificação e avaliação de uma isoforma de hialuronidase (Dietrich's Hyaluronidase) do veneno de Loxosceles intermedia (aranha-marrom) : da clonagem molecular à caracterização bioquímica e funcional

Abstract

Resumo: Loxoscelismo é o termo utilizado para os sintomas clínicos desencadeados após a picada de aranhas do gênero Loxosceles. As manifestações clínicas incluem necrose da pele com espalhamento gravitacional e complicações sistêmicas. O veneno loxoscélico contém várias enzimas, como por exemplo, fosfolipases-D, serinoproteases, metaloproteases e hialuronidases. As hialuronidases ao degradar glicosaminoglicanos de tecido conjuntivo potencializaria a ação de outros componentes do veneno facilitando a penetração e distribuição dos mesmos a diferentes tecidos. Este trabalho teve como objetivo a clonagem, expressão e caracterização bioquímica e biológica de uma isoforma de hialuronidase do veneno de L. intermedia (aranha-marrom). Através de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno, uma isoforma de hialuronidase (1200 pb) foi clonada e denominada Dietrich's Hyaluronidase (DHAase). Após subclonagem da hialuronidase madura em vetor de expressão pET-14b, a construção resultante foi transformada em Escherichia coli BL21(DE3)pLysS e AD494(DE3). Fora testada a expressão em volume de 50 mL em diferentes concentrações de indutor IPTG (0,05-0,4 mM) e diferentes temperaturas (30º, 22º e 16ºC). Para obtenção da solubilidade da enzima recombinante, a sequência da hialuronidase madura foi também clonada em vetor de expressão pET-SUMO e expressa em E. coli SHuffle a 30ºC sob as mesmas condições de indutor descritas anteriormente. Em um maior volume de cultura (1L) nenhuma das cepas foi eficiente em expressar a DHAase solúvel. Sendo assim a alternativa escolhida para conseguir a hialuronidase recombinante de forma solúvel e ativa foi a técnica de redobramento in vitro. Vários tampões foram testados e a atividade só foi obtida com um tampão contendo glutationas, albumina bovina (BSA) e L-arginina. Depois do redobramento, DHAase foi capaz de degradar ácido hialurônico (HA) e condroitim-4-sulfato (C4S) em ensaios de cinética e zimografia. Por meio de análises de imunodetecção foi visto que anticorpos policlonais produzidos com a DHAase desnaturada e com o veneno reagiram de forma cruzada. Através de experimentos in vivo de dermonecrose em pele de coelho, foi demonstrado que DHAase aumentou a área de necrose produzida por uma isoforma de fosfolipase-D recombinante (toxina dermonecrótica) do veneno de L. intermedia (LiRecDT1). Dados macroscópicos e histológicos suportam a hipótese de que a hialuronidase é um "fator de espalhamento" do veneno de L. intermedia. Adicionalmente, estudando modelos in vitro de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) e células de melanoma murino (B16F1 e B16F10) onde essas células foram expostas por até 24 h com DHAase, foi visto que a hialuronidase recombinante não induziu alteração da morfologia ou desadesão das RAECs. Por outro lado ela alterou a proliferação e a morfologia das células de melanoma murino, sendo que a linhagem mais metastática (B16F10) teve os efeitos mais pronunciados sob a ação de DHAase. A viabilidade celular de B16F10 diminui significativamente com a exposição da hialuronidase recombinante por 16 h. Dietrich's Hyaluronidase foi uma ferramenta útil para um estudo pioneiro no loxoscelismo e se mostrou eficiente em estudar o efeito do catabolismo de HA em linhagens cancerosas de melanoma, embora estudos adicionais se façam necessários. Em conclusão, o presente trabalho tornou evidente a possível utilização de DHAase como uma ferramenta de estudo em processos patológicos relacionados ao ácido hialurônico. Palavras-chave: Loxosceles, aranha-marrom, veneno, ácido hialurônico, hialuronidases, proteínas recombinantes, redobramento in vitro, melanoma.

Abstract:Loxoscelism is the designation given to clinical symptoms evoked by Loxosceles spider's bites. Clinical manifestations include skin necrosis with gravitational spreading and systemic disturbs. The venom contains several enzymatic toxins such as phospholipase-D, serine proteases, metalloproteases and hyaluronidases. Hyaluronidases by degrading glycosaminoglycans from connective tissue may be able to enhance the action from other venom constituents by facilitating the diffusion from local bite to other tissues. This work aimed the cloning, expression and the biochemical and biological characterization of a hyaluronidase isoform from L. intermedia venom (brown spider). Employing a venom gland cDNA library, we cloned a hyaluronidase (1200 bp) which was named Dietrich's Hyaluronidase (DHAase). The mature sequence was subcloned with a pET-14b plasmid and the expressed construction was inserted into E. coli BL21(DE3)pLysS and AD494(DE3). The induction of recombinant protein expression was tested in different IPTG concentrations (0.05-0.4 mM) and temperatures (30º, 22º and 16ºC). The DHAase mature sequence was also subcloned with pET-SUMO and it was expressed in E. coli SHuffle at 30ºC with the same IPTG concentrations. Neither of E.coli strains tested was able to express DHAase in a soluble form in large scale. The chosen alternative to achieve a soluble and active DHAase was the refolding in vitro technique. Several conditions were tested and the activity was only reached with a buffer containing glutathione, bovine serum albumin (BSA) and L-arginine. After the refolding, the recombinant hyaluronidase was able to degrade hyaluronic acid (HA) and chondroitin-4-sulfate (C4S) in a kinetic assay and zymography. Immunoblot analysis showed that antibodies which recognize the DHAase cross-reacted with native hyaluronidases from the whole venom as well as an anti- whole venom serum reacted with the recombinant protein. Through in vivo experiments of dermonecrosis using rabbit skin, DHAase was shown to increase the dermonecrotic effect produced by recombinant dermonecrotic toxin (phospholipase-D) from L. intermedia venom (LiRecDT1). Macroscopic and histologic findings sustain these data. Together, results support the hypothesis that hyaluronidase is a ''spreading factor'' from L. intermedia venom. In addition, studying in vitro culture model of rabbit aortic endhotelial cells (RAEC) and murine melanoma cells (B16F1 e B16F10), which the cells were exposed up to 24 h with DHAase, showed that recombinant hyaluronidase not induced RAEC's morphologic changes neither cell detachment. On the other hand, it caused morphologic and cell proliferation changes in melanoma cells. B16F10, a more metastatic subtype, was more affected by hyaluronidase action than the B16F1. The B16F10 cell viability was significantly reduced by DHAase within 16 h. DHAase provided a useful tool for a pioneering study into loxoscelism and it was efficient in studying the HA metabolites effect in melanoma cancer cells, although further studies are necessary. In conclusion, this work provide evidences of the use of DHAase as a tool for studying HA pathological process. Keywords: Loxosceles, brown spider, venom, hyaluronic acid, hyaluronidases, recombinant protein, refolding in vitro, melanoma