Avaliação dos efeitos da N-acetilcisteína sobre o estresse oxidativo induzido por soro urêmico em células vasculares

Abstract

Resumo: O acúmulo de toxinas urêmicas no plasma de doentes renais está relacionado a um estresse oxidativo sistêmico. Uma vez que a doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morte na doença renal crônica (DRC) e as células vasculares estão em contato direto com toxinas urêmicas acumuladas no sangue desses pacientes, o presente estudo visou investigar o papel da uremia na indução de estresse oxidativo em células vasculares, bem como o efeito do antioxidante N-acetilcisteína (NAC) na inibição de tal estresse e seus efeitos. Pools de soros humanos urêmico e não urêmico foram coletados e caracterizados. A diminuição dos níveis de tióis e o aumento nos níveis de carbonilas no soro urêmico confirmaram o estresse oxidativo sistêmico na doença renal. Células endoteliais (RAEC) e musculares lisas de aorta de coelho (RASM) foram cultivadas com 10% dos pools. O soro urêmico induziu um aumento de 23,5% e 25,6% na produção de superóxido após 3 e 24h, respectivamente, comparado ao soro não urêmico, determinada pela oxidação da dihidroetidina (DHE). Esta produção de superóxido está relacionada a NADPH oxidase, uma vez que a pré-incubação com apocinina, um inibidor desta oxidase, inibiu 41,5% a detecção do hidroxietídeo. A utilização da sonda Mitosox Red mostrou que mitocôndria também contribui para a produção de superóxido estimulada pelo soro urêmico em células vasculares em um período de 24 horas de exposição, aumentado em cerca de 15%. Quanto à biodisponibilidade de óxido nítrico, os resultados obtidos demonstraram que a liberação de NO esteve aumentada em células endoteliais e musculares lisas após 3 horas de tratamento (33,4%), indicados pela reação de NO produzido com a sonda DAF-2DA. Este fato sugere que o soro urêmico, nesse tempo, pode afetar a produção do NO, podendo estar relacionado ao desenvolvimento de aterogênese em doentes renais crônicos. Os efeitos crônicos da uremia no sistema de defesa antioxidante foram investigados pela determinação da razão de GSHtotal/GSSG, através do método colorimétrico por DTNB, após 3, 6 e 24 horas de tratamento. Comparado ao soro não urêmico, foi observada uma diminuição nessa razão em 6 horas de tratamento (33,4%), indicando uma queda na defesa antioxidante e um favorecimento do produto oxidado, demonstrando que a produção de radicais livres é particularmente prejudicial neste contexto. Foi verificada também a modificação de proteínas celulares na presença do soro urêmico, a primeira através de imunoflorescência indireta, no qual se observou um aumento na nitração de proteínas durante 3 e 24 horas em relação ao soro não urêmico, e na segunda através de um ensaio colorimétrico por dinitrofenil hidrazina (DNPH), no qual a produção de carbonilas protéicas também apresentou-se aumentada nos períodos de 3 e 24 horas quando expostas à uremia. Efeitos antioxidantes de NAC puderam ser observados neste estudo, uma vez que reduziu a produção de superóxido, evidente em 24 horas de exposição ao soro urêmico (81,5%), semelhantemente à apocinina, a produção de peróxido de hidrogênio (40%), de óxido nítrico (41,4%) e seus efeitos como a nitração de proteínas, bem como a carbonilação protéica (40,6%). Estes resultados confirmam o estresse oxidativo induzido pelas toxinas urêmicas, indicando alguns mecanismos envolvidos. Também, mostram que a administração de NAC é potencialmente útil na prevenção tanto de produção de ROS/RNS como na inibição dos danos oxidativos em doentes renais crônicos, sendo visto como um promissor agente terapêutico direcionado a conter complicações decorrentes da uremia.

Abstract: The accumulation of uremic toxins in kidney failure patients plasma is related to a systemic oxidative stress. Since cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of death in chronic kidney disease (CKD) and the vascular cells are in direct contact with such uremic toxins, this study aimed to investigate the role of uremia in the induction oxidative stress in vascular cells, as well as the effect of antioxidant N-acetylcysteine (NAC) in the inhibition of this stress and its effects. Pools of human uremic and non uremic sera were collected and characterized. The decreased levels of thiols and increased levels of carbonyls in uremic serum confirmed the systemic oxidative stress in CKD. Endothelial cells (RAEC) and smooth muscle of rabbit aorta (RASM) were cultured with 10% of the pools. Uremic serum induced an increase of 23.5% and 25.6% in superoxide production after 3 and 24, respectively, compared to non-uremic serum, determined by the oxidation of dihydroethydium (DHE). This superoxide production is related to NADPH oxidase, since the pre-incubation with apocynin, an inhibitor of this oxidase, inhibited in 41.5% the hydroxyethidium detection. The use of Mitosox Red probe showed that mitochondria also contributes to the production of superoxide stimulated by uremic serum in vascular cells. After 24 hours of exposure, Mitosox fluorescence increased by about 15%. Regarding the NO bioavailability, the results demonstrated that NO release was augmented in endothelial cells and smooth muscle after 3h of treatment (33.4%), indicated by the reaction of NO with the DAF-2DA probe. This fact suggests that uremic serum, at this time, can affect the production of NO, which may be related to the development of atherogenesis in chronic renal failure patients. The effects of chronic uremia in the antioxidant defense system were investigated by determining the ratio GSHtotal / GSSG, using the colorimetric method by DTNB, after 3, 6 and 24 hours of treatment. Compared to non-uremic serum, we observed a decrease in this ratio at 6 hours of treatment (33.4%), indicating a decrease in antioxidant defense in favor of the oxidized product, suggesting that reactive species production be particularly harmful at this time. It was verified the modification of cellular proteins in the presence of uremic serum. By indirect immunofluorescence, we observed an increased protein nitration after 3 and 24 hours in relation to non-uremic serum. And through a colorimetric assay using dinitrophenyl hydrazine (DNPH), we showed that protein carbonyl levels are increased after 3 and 24 hours in cells exposed to the uremic serum. Antioxidant effects of NAC were observed in this study. Pre-treatment with NAC reduced the production of superoxide, evident after 24h-exposure (81.5%), the production of hydrogen peroxide (40%), nitric oxide (41.4%) and the levels of protein nitration and carbonylation (40.6%). These results confirm the oxidative stress induced by uremic toxins, indicating some of the mechanisms involved. In addition, they show thatI NAC administration may be potentially useful both in preventing ROS / RNS production and inhibiting the resulting oxidative damage in CKD patients, which may be envisaged as a promising therapeutic agent against uremia complications.