Estudo das atividades biológicas in vitro da 5-(2,3-Dihidroxi-3-Metilbutilox)-6,7- Metilenedioxicumarina isolada de Pterocaulon lorentzii Malme E Pterocaulon alopecuroides DC. com ênfase na atividade anti-helmíntica em Nematoides gastrintestinais de ovinos

Abstract

Resumo: Infecções gastrintestinais causadas por nematoides constituem um dos principais fatores limitantes para a ovinocultura no Brasil e em todo o mundo. A saúde dos rebanhos depende de um controle antiparasitário eficiente e a utilização de plantas medicinais como alternativa fitoterápica na medicina veterinária vêm ganhando espaço e se mostrando próspera. Tendo em vista os aspectos sociais, econômicos e ambientais este trabalho tem por objetivo estudar numa abordagem multidisciplinar a efetividade dos extratos, frações e da 5-(2,3-dihidroxi-3-metilbutiloxi)-6,7-metilenedioxicumarina isolada das espécies Pterocaulon alopecuroides DC. e Pterocaulon lorentzii Malme. Como foco buscou-se a efetividade destas espécies em ensaios antiparasitários in vitro contra nematoides gastrintestinais de ovinos além dos seus potenciais antioxidantes e da toxicidade. As partes aéreas secas e estabilizadas de ambas espécies foram submetidas a extração com etanol e particionadas com solventes com gradiente de polaridade crescente hexano-clorofórmio-acetato de etila em aparelho de soxhlet modificado. A partir da cromatografia líquida em coluna da fração clorofórmio e elucidação estrutural por RMN 1H e 13C foi identificada a cumarina 5-(2,3-dihidroxi-3- metilbutiloxi)-6,7-metilenedioxicumarina. Os extratos brutos, as frações e a cumarina foram submetidos a bioensaios in vitro para avaliação de toxicidade, atividade antioxidante, e atividade anti-helmíntica. Na avaliação da ecotoxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina as amostras testadas apresentaram atividade apenas em concentrações superiores a 1000?g/mL, consideradas não tóxicas neste ensaio. Da mesma forma, na avaliação da atividade hemolítica, tanto no teste em sangue de carneiro como em ágar sangue os extratos, as frações e a cumarina não apresentaram atividade. O potencial antioxidante foi avaliado por três metodologias. No teste de inibição do complexo fosfomolibdênio destacou-se a fração acetato de etila de P. alopecuroides que apresentou 36,4% de atividade em relação à vitamina C e 137,7% em relação à rutina. A fração acetato de etila de P. lorentzii também apresentou maior atividade em relação às demais amostras testadas ARR(%) de 101,7% em relação à vitamina C. No método de reação com o radical DPPH as frações acetato de etila de ambas espécies mostraram as melhores atividades, EC50 10,74 ?g/mL para P. alopecuroides e EC50 7,63 ?g/mL para P. lorentzii, em relação ao controle vitamina C (EC50 2,48 ?g/mL) e rutina (EC50 9,43 ?g/mL). As demais amostras, extrato bruto, fração hexano, fração clorofórmio e cumarina não apresentaram atividade significativa. No teste de reação ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) as amostras mais expressivas foram os extratos brutos das duas espécies em relação ao controle positivo BHT cujo IA% 0,169 ± 0,0087. O extrato bruto de P. alopecuroides apresentou IA% 0,419 ± 0,0517 e o extrato bruto de P. lorentzii IA% 0,213 ± 0,0094. Já a 5-(2,3-dihidroxi-3-metilbutiloxi)-6,7- metilenedioxicumarina apresentou IA% 0,462 ± 0,0184. Na avaliação da atividade antihelmíntica pelo método da eclodibilidade de ovos de nematoides a cumarina apresentou atividade muito expressiva na inibição do desenvolvimento e eclosão dos ovos com EC50 3,2 ?g/mL, seguido das frações clorofórmio 17,2 ?g/mL (P. alopecuroides) e 9,4 ?g/mL (P. lorentzii) enquanto que as demais frações e extratos apresentaram atividades menores. Da mesma forma a cumarina apresentou maior atividade na inibição da migração de larvas de nematóides em ágar com EC50 3,1 ?g/mL e as frações clorofórmio 104,1?g/mL (P. alopecuroides) e 64,7 ?g/mL (P. lorentzii). Os resultados obtidos sugerem a aplicação dos extratos e frações de P. alopecuroides e P. lorentzii e a 5-(2,3-dihidroxi-3-metilbutiloxi)-6,7-metilenedioxicumarina no desenvolvimento de preparações farmacêuticas de uso veterinário.

Abstract: Gastrointestinal infection caused by nematodes are the main limiting factor for sheep breeding in Brazil and around the world. Livestock healthiness depends on an efficient anthelmintic control and the use of medicinal plants as an herbal alternative in veterinary medicine is gaining space and showing prosperous. Considering the social, economic and environmental scope this work aims to study in a multidisciplinary approach, the effectiveness of extracts, fractions and 5-(2,3-dihydroxy-3-methylbutyloxy)-6,7- methylenedioxicoumarin isolated from Pterocaulon alopecuroides DC. and Pterocaulon lorenztii Malme species. This study was focused on the effectiveness of these two species in vitro anthelmintic assays against sheep gastrointestinal nematodes as well as their antioxidant and toxicity potential. The dried and stabilized aerial parts of both species were subjected to extraction with ethanol and partitioned with solvents of increasing polarity gradient hexane-chloroform-ethyl acetate in modified soxhlet apparatus. From the liquid column chromatography of chloroform fraction an the structure elucidation by NMR 1H and NMR 13H the 5-(2,3-dihydroxy-3-methylbutyloxy)- 6,7-methylenedioxicoumarin was identified. The crude extracts, fractions and the coumarin were submitted to in vitro bioassays to evaluate toxicity, antioxidant activity, and anthelmintic activity. In the ecotoxicity assessment against Artemia salina tested samples showed activity only at concentrations over 1000?g/mL considered non-toxic in this assay. Likewise, in the hemolytic activity assay test in sheep blood and blood agar, extracts, fractions and the coumarin showed no activity. The scavenging activity was evaluated by three methods. In the phosphomolybdenium complex inhibition test the ethyl acetate fraction of P. alopecuroides showed 36.4% activity compared to vitamin C and 137.7% compared to rutin. The ethyl acetate fraction of P. lorentzii also showed higher activity in comparison to other samples tested with ARR (%) 101.7% compared to vitamin C. In DPPH reaction methods ethyl acetate fractions of both species showed the best activities, EC50 10.74 mg/mL for P. alopecuroides and EC50 7.63 mg/mL for P. lorentzii compared to the control Vitamin C (EC50 2.48g/mL) and rutin (EC50 9.43 g/mL). The remaining samples, crude extract, hexane fraction, chloroform fraction and the coumarin showed no significant activity. The crude extracts of the two species showed the most significant results in thiobarbituric acid reaction test (TBARS) in relation to the positive control BHT (AI 0.169 ± 0.0087%). The crude extract of P. alopecuroides presented IA 0.419% ± 0.0517 and the crude extract of P. lorentzii IA 0.213% ± 0.0094. The 5-(2,3-dihydroxy-3-methylbutyloxy)-6,7-methylenedioxicoumarin showed0020cIA 0.462% ± 0.0184. In the evaluation of anthelmintic activity by the egg hatch test (EHT) the coumarin showed very significant activity in inhibiting sheep nematoid egg development hatching with EC50 3.2 mg/mL, followed by chloroform fractions 17.2?g/mL (P. alopecuroides) and 9.4 mg/mL (P. lorentzii) while the other fractions and extracts showed lower activity. As well as in the EHT the same coumarin showed higher effectiveness in inhibiting nematode larvae migration in agar with a EC50 3.1 g/mL followed by the chloroform fractions 104.1g/mL (P. alopecuroides) and 64.7 mg/mL (P. lorentzii). The obtained results suggest the application of extracts and fractions of P. alopecuroides and P. lorentzii and 5-(2,3-dihydroxy-3-methylbutyloxy)-6,7- methylenedioxicoumarin in the development of pharmaceutical preparations for veterinary use.