Análise proteômica de citrumelo "swingle" ( Citrus paradisi Macfad. cv. Duncan x Poncirus trifoliata (l.) Raf. ) com alto acúmulo de prolina em situação de déficit hídrico

Abstract

Resumo: A citricultura é uma das atividades mais importantes do agronegócio brasileiro e o uso de porta-enxertos está intimamente associado à competitividade dos pomares, pois influencia diversas características agronômicas de interesse da copa. O porta-enxerto citrumeleiro Swingle (Citrus paradisi Macfad. Cv. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) transformado com o gene mutante P5CSF129A de Vigna acontifolia que codifica para a enzima ?1-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) proporciona alto acúmulo do aminoácido prolina e mostra-se mais tolerante a situações de déficit hídrico quando comparado com plantas não transformadas. O objetivo deste trabalho foi identificar proteínas diferencialmente expressas em plantas de citrumeleiro "Swingle" com alto acumulo de prolina, devido à expressão constitutiva do transgene P5CSF129A sob controle do promotor 35S CaMV, tanto em condições de déficit hídrico como em condições normais de suprimento de água. O estado hídrico nas folhas foi monitorado através de psicrômetros e as análises foram feitas em tecidos foliares de plantas transformadas e não transformadas com suprimento hidrico adequado (?t = -1,1 a -1,5 MPa) e em situacao de estresse (?t = de -3,0 a -3,5 MPa). A expressão diferencial de proteínas devido ao alto acúmulo de prolina foi feita comparando-se plantas controles e transgênicas em condições normais de suprimento de água. Já as comparações entre plantas transgênicas irrigadas e estressadas foram realizadas para identificar diferenças de expressão nas plantas com alto acúmulo de prolina devido ao estresse, enquanto comparações entre plantas controle em situação irrigada e estressada visaram identificar proteínas expressas em plantas não-transformadas devido ao estabelecimento de estresse hídrico. Os teores de prolina livre nas amostras foliares em condição irrigada mostraram-se cerca de 2,5 vezes maiores nas plantas transgênicas do que nas plantas controle. Com a imposição do estresse, os níveis de prolina mantiveram-se praticamente constantes nas plantas transgênicas (cerca de 350 ?mol g. MF-1) e aumentaram em media 40% nas plantas controle (175 ?mol g. MF-). Para análise proteômica, proteínas totais de tecido foliar, extraídas pelo método fenol/SDS, foram separadas por eletroforese bi-dimensional utilizando tiras IPG de 13 cm em pH 4- 7 na primeira dimensão para posterior separação por SDS PAGE. As imagens dos géis foram analisadas com programa ImageMaster Platinum 6.0 para identificação dos spots diferenciais devido ao acúmulo de prolina ou estresse hídrico. Estes spots foram digeridos com tripsina e os peptídeos analisados com espectrômetro de massa MALDI-TOF-TOF possibilitando a identificação de 17 proteínas por Peptide Mass Fingerprinting (PMF), sequenciamento de novo e MS/MS íon search. As buscas foram feitas no programa Mascot para análises de PMF e MS/MS íon search, ou a partir de comparações das seqüências geradas pelo sequenciamento de novo com dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information). As comparações entre as plantas controle nas duas situações hídricas (irrigado e estressado) possibilitaram a identificação das proteínas ATP sintase subunidade b, taxano 2-alfa-O-benzoiltransferase, proteína de ligação a clorofila a/b, proteína de ligação ao RNA rica em glicina, álcool desidrogenase, promotor de crescimento independente de auxina e rubisco ativase. Quando comparadas as plantas transgênicas irrigadas e estressadas, identificaram-se as proteínas ATP sintase subunidades b e ?, fosfoglicerato quinase, receptor de etileno e complexo de evolução do oxigênio (OEC). Já ao se contrastar plantas controle e transgênicas em condições normais de suprimento hídrico foram identificadas as proteínas lectina, hemoglobina e miraculina.