Análise proteômica de citrumelo "swingle" ( Citrus paradisi Macfad. cv. Duncan x Poncirus trifoliata (l.) Raf. ) com alto acúmulo de prolina em situação de déficit hídrico

Abstract

Resumo: A citricultura é uma das atividades mais importantes do agronegócio brasileiro e o uso de porta-enxertos está intimamente associado à competitividade dos pomares, pois influencia diversas características agronômicas de interesse da copa. O porta-enxerto citrumeleiro Swingle (Citrus paradisi Macfad. Cv. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) transformado com o gene mutante P5CSF129A de Vigna acontifolia que codifica para a enzima ?1-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) proporciona alto acúmulo do aminoácido prolina e mostra-se mais tolerante a situações de déficit hídrico quando comparado com plantas não transformadas. O objetivo deste trabalho foi identificar proteínas diferencialmente expressas em plantas de citrumeleiro "Swingle" com alto acumulo de prolina, devido à expressão constitutiva do transgene P5CSF129A sob controle do promotor 35S CaMV, tanto em condições de déficit hídrico como em condições normais de suprimento de água. O estado hídrico nas folhas foi monitorado através de psicrômetros e as análises foram feitas em tecidos foliares de plantas transformadas e não transformadas com suprimento hidrico adequado (?t = -1,1 a -1,5 MPa) e em situacao de estresse (?t = de -3,0 a -3,5 MPa). A expressão diferencial de proteínas devido ao alto acúmulo de prolina foi feita comparando-se plantas controles e transgênicas em condições normais de suprimento de água. Já as comparações entre plantas transgênicas irrigadas e estressadas foram realizadas para identificar diferenças de expressão nas plantas com alto acúmulo de prolina devido ao estresse, enquanto comparações entre plantas controle em situação irrigada e estressada visaram identificar proteínas expressas em plantas não-transformadas devido ao estabelecimento de estresse hídrico. Os teores de prolina livre nas amostras foliares em condição irrigada mostraram-se cerca de 2,5 vezes maiores nas plantas transgênicas do que nas plantas controle. Com a imposição do estresse, os níveis de prolina mantiveram-se praticamente constantes nas plantas transgênicas (cerca de 350 ?mol g. MF-1) e aumentaram em media 40% nas plantas controle (175 ?mol g. MF-). Para análise proteômica, proteínas totais de tecido foliar, extraídas pelo método fenol/SDS, foram separadas por eletroforese bi-dimensional utilizando tiras IPG de 13 cm em pH 4- 7 na primeira dimensão para posterior separação por SDS PAGE. As imagens dos géis foram analisadas com programa ImageMaster Platinum 6.0 para identificação dos spots diferenciais devido ao acúmulo de prolina ou estresse hídrico. Estes spots foram digeridos com tripsina e os peptídeos analisados com espectrômetro de massa MALDI-TOF-TOF possibilitando a identificação de 17 proteínas por Peptide Mass Fingerprinting (PMF), sequenciamento de novo e MS/MS íon search. As buscas foram feitas no programa Mascot para análises de PMF e MS/MS íon search, ou a partir de comparações das seqüências geradas pelo sequenciamento de novo com dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information). As comparações entre as plantas controle nas duas situações hídricas (irrigado e estressado) possibilitaram a identificação das proteínas ATP sintase subunidade b, taxano 2-alfa-O-benzoiltransferase, proteína de ligação a clorofila a/b, proteína de ligação ao RNA rica em glicina, álcool desidrogenase, promotor de crescimento independente de auxina e rubisco ativase. Quando comparadas as plantas transgênicas irrigadas e estressadas, identificaram-se as proteínas ATP sintase subunidades b e ?, fosfoglicerato quinase, receptor de etileno e complexo de evolução do oxigênio (OEC). Já ao se contrastar plantas controle e transgênicas em condições normais de suprimento hídrico foram identificadas as proteínas lectina, hemoglobina e miraculina.

Abstract: Citriculture is one of the most important agribusiness activities in Brazil and the use of rootstocks is closely associated with citrus orchard competitiveness by affecting various important agronomic characteristics. Citrumelo Swingle plants (Citrus paradisi Macfad. Cv. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) expressing the mutant gene P5CSF129A of Vigna acontifolia, that codes for the enzyme ?1- pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS), accumulate high free proline. These plants have been shown to present greater tolerance to water deficit when compared to non transformed plants. The objective of this work was to identify differentially expressed proteins in leaves of citrumelo Swingle transgenic plants with high proline accumulation, due to the constitutive expression of the transgene P5CSF129A under control of the 35S CaMV promoter, under normal water supply conditions and when subjected to water deficit. Leaf water status was monitored through psychrometers and proteomic analysis were carried out using leaf tissues of transgenic and control plants with normal water supply (?t = -1,1 to -1,5 MPa) and under stress situation (?t = de -3,0 to -3,5 MPa). The differential protein expression caused by high proline accumulation was performed comparing control and transgenic plants in irrigated condition. Comparisons of irrigated with stressed transgenic plants were done to identify differentially expressed proteins in plants with high proline accumulation when submitted to water deficit, while comparisons between non transformed plants under irrigated and stressed conditions were carried out to identify proteins expressed in citrumelo Swingle due to the establishment of water stress. The levels of free proline in leaf samples in normal water supply conditions were about 2.5 times higher in transgenic plants than in non transformed control plants. With the stress imposition, proline levels remained almost invariable in transgenic plants (about 350 ?mol g. MF-1) and increased 40% in control plants (175 ?mol g. MF-1). For proteomic analysis, total leaf proteins were extracted by phenol/SDS method and separated by bi-dimensional electrophoresis using IPG strips of 13 cm with pH gradient immobilized at 4-7 in the first dimension for further separation by SDS PAGE. The 2D-gel images were analyzed through ImageMaster Platinum 6.0 program to identify differential spots due to proline accumulation or water stress. These spots were digested with trypsin and the peptides analysis with mass spectrometer MALDI-TOF-TOF enabled the identification of 17 proteins by Peptide Mass Fingerprinting (PMF), de novo sequencing and MS/MS íon search. The searches were made in Mascot for PMF e MS/MS íon search analysis or by direct comparison of the sequences generated by de novo sequencing with the data in NCBI database (National Center for Biotechnology Information). Comparisons between control plants in both water supply situations (irrigated and drought) identified the following proteins: subunit b ATP sinthase, taxane 2-alpha-O-benzoil transferase, chlorophyll a/b binding protein, RNA binding protein glycine rich, alcohol dehydrogenase, growth promoter auxin-independent and rubisco activase. When irrigated and drought stressed transgenic plants were compared, we identified the proteins ? / ? subunit ATP sinthase, phosphoglycerate kinase, ethylene receptor and oxygen- evolving complex protein. Finally, comparisons between control and transgenic plants overproducing proline under normal water supply conditions showed modification of the expression of lectin, hemoglobin and miraculin.