Diagnóstico sorológico de Neospora sp. e Toxoplasma gondii e sua investigação no sêmen de garanhões em propriedades com falhas reprodutivas em éguas

Abstract

Resumo: A perda da prenhez é uma das principais causas de prejuízo econômico em uma criação de equinos. As causas de aborto podem ser de origem não infecciosa ou infecciosa. A disseminação de bactérias, vírus e protozoários pode ocorrer através do sêmen e o garanhão pode ser um portador assintomático de agentes patogênicos que causam perdas reprodutivas em éguas. Entre as causas infecciosas, o aborto causado por protozoários, principalmente por Neospora sp. raramente é incluído no diagnóstico diferencial das perdas reprodutivas. O presente estudo contém uma revisão de literatura sobre as principais causas de aborto por protozoário e vírus na égua, e dois capítulos com as pesquisas realizadas. No capítulo 1 está o estudo sobre a ocorrência de anticorpos contra Neospora sp. e contra Toxoplasma gondii em éguas com e sem histórico de falhas reprodutivas e a presença de cães e bovinos como fatores de risco para a soroprevalência de Neospora sp. em éguas. As soroprevalências de Neospora sp. foram 25,71% (9/35), nas éguas com histórico de falhas reprodutivas, e 6,49% (5/77), nas éguas sem histórico de falhas reprodutivas. Através do teste qui-quadrado, com um nível de significância de alpha=0,05, verificou-se diferença estatisticamente significativa entre as éguas com e sem histórico de falhas reprodutivas e a soroprevalência de Neospora sp. As soroprevalências de T. gondii foram de 2,85% (1/35), nas éguas com histórico de falhas reprodutivas e de 1,29% (1/77) nas éguas sem histórico de falhas reprodutivas. Não foi observada diferença estatística significativa entre a presença de cães e a soroprevalência de Neospora sp. nas éguas. A presença de bovinos foi considerada como fator de risco para Neospora sp. nas éguas, com diferença estatística significativa em relação à presença destes animais e a soropositividade ao parasita nas éguas (X²= 9,3414; p = 0,00224). No capítulo dois, um estudo inédito foi realizado sobre a investigação dos protozoários Neospora sp. e T. gondii em amostras de sêmen de reprodutores equinos através do cultivo celular e da reação em cadeia da polimerase (PCR). As colheitas de sêmen foram realizadas de oito garanhões, clinicamente saudáveis, através da vagina artificial. Os ejaculados foram centrifugados e a porção contendo os espermatozóides foi recuperada, sendo uma parte inoculada no cultivo celular com células Vero, e a restante mantida a - 20ºC até o momento da extração de DNA, realizada pelo método de fenolclorofórmio. As amostras obtidas do cultivo celular do sêmen e do sêmen in natura foram submetidas à amplificação por PCR, utilizando iniciadores que delimitam o segmento de DNA da região Nc5 de N. caninum (Np6/Np21), da região ITS1 (ITS2/ITS5) e da região 18S (FE/RE; FE/RI). Não foi verificado o crescimento de protozoários no cultivo celular do sêmen. Apenas para a região 18S ocorreu amplificação de DNA das amostras obtidas do cultivo celular do sêmen e do sêmen in natura. As amostras foram sequenciadas e as sequências obtidas do cultivo celular do sêmen foram compatíveis com Acanthamoeba rhysodes e A. castellanii. Os protozoários Neospora sp. e T. gondii não foram encontrados no sêmen dos reprodutores avaliados. Os protozoários encontrados neste estudo podem ser provenientes do ambiente e estarem presentes no prepúcio, contaminando o sêmen. A presença destes agentes e suas consequências na reprodução em equinos até hoje é desconhecida.

Abstract: Abortion is one of the major factors contributing to infertility in equine species, representing one of the most important economic problems for horse breeders. The causes of abortions may be infectious or non-infectious in origin. Bacteria, viruses and protozoa can also be disseminated through semen and the stallion may be an asymptomatic carrier of diseases causing reproductive failure in mares. In addition to infectious origins, abortion caused by protozoa, mainly by Neospora sp. is rarely included in the differential diagnosis of reproductive failure. This study contains a literature review of the main causes of abortion caused by protozoas and viruses in mares, and two chapters with surveys undertaken. Chapter 1 of this study addresses the occurrence of antibodies against Neospora sp. and Toxoplasma gondii in mares with and without a history of reproductive failure and the presence of dogs and cattle as risk factors for seroprevalence of Neospora sp. in mares. In mares with a history of reproductive failure seroprevalence obtained for Neospora sp. was 25.71% (9/35) and in mares with no history of reproductive failure corresponded to 6.49% (5/77). Utilizing the chi-square test, (alpha = 0.05), a significant difference between mares with and without a history of reproductive failure was noted as well as the seroprevalence for Neospora sp. The seroprevalence of T. gondii was 2.85% (1/35) in mares with a history of reproductive failure and 1.29% (1/77) in mares with no history of reproductive failure. There was no statistically significant difference between the presence of dogs and the seroprevalence of Neospora sp. in mares. The presence of cattle was considered as a risk factor to Neospora sp. in mares, with a statistically significant difference regarding the presence of these animals and seropositive of this parasite in mares (X ² = 9.3414, p = 0.00224). In chapter two, an original research paper was conducted to determine the presence of the protozoa Neospora sp. and T. gondii in semen samples from stallions from properties with a history of reproductive failure and mares seropositive for Neospora sp. and T. gondii, through the cell culture and polymerase chain reaction (PCR). The semen samples were collected from eight stallions, clinically healthy with an artificial vagina. One ejaculate was collected from each animal and analyzed. Ejaculates were centrifuged and the portion containing the sperm cells were recovered and inoculated with cell culture in Vero cells, and the rest kept at -20°C until DNA extraction by the method of phenol-chloroform. The samples obtained from cell cultures of semen and semen in natura were submitted to PCR amplification using primers that define the DNA segment Nc5 of the region of N. caninum (Np6/Np21), ITS1 (ITS2/ITS5) and 18S (FE/RE; FE/RI). The protozoan was not detected in cell culture of the semen samples. Only for the 18S region DNA was amplified from samples obtained from cell cultures of semen and from semen in natura. The samples were sequenced and sequences obtained from cell cultures of semen were consistent with Acanthamoeba rhysodes and A. castellanii. The protozoan Neospora sp. and T. gondii were not found in the semen of the stallions evaluated. The protozoa found in this study may come from the environment and be present on the prepuce, contaminating the semen. The presence of these agents and their effects on reproduction in horses is unknown until today.