Clonagem e expressão heteróloga de uma nova isoforma de metaloprotease do tipo astacina presente no veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)

Abstract

Resumo: O veneno das aranhas do gênero Loxosceles é composto por várias classes de moléculas biologicamente ativas com ação tóxica e/ou enzimática. Dentre estas toxinas, destacam-se serinoproteases, fosfolipases, hialuronidases e metaloproteases do tipo astacinas. As astacinas são enzimas secretadas e estão relacionadas a eventos envolvendo homeostase; ovulação e fertilização; embriogênese, como na morfogênese de tecidos; proliferação e migração celular; progressão do ciclo celular e apoptose; entre outros. Durante o envenenamento, o papel das metaloproteases no local da picada deve estar relacionado com a degradação de componentes da Matriz Extracelular, sendo então consideradas possíveis fatores de espalhamento. Por meio de estudos envolvendo biologia molecular foi possível caracterizar três isoformas de proteínas to tipo astacinas no veneno de Loxosceles intermedia, determinadas LALP1, LALP2 e LALP3. Destas, apenas a LALP1 clonada e obtida através de expressão heteróloga. Foi demonstrado que a LALP1 possui atividade sobre moléculas de matriz extracelular, como gelatina, fibrinogênio e fibronectina. Ainda, dados recentes demonstraram que as proteases do tipo astacinas constituem uma família de genes em aranhas do gênero Loxosceles e que novas isoformas podem ser encontradas. Por conseguinte, o objetivo deste trabalho foi efetuar a clonagem e expressão heteróloga de uma nova isoforma de metaloprotease presente no veneno de L. intermedia por meio de técnicas de biologia molecular, visando ainda possibilidades futuras de estudos estruturais e funcionais desta enzima. A predição da estrutura tridimensional da LALP3 revelou que a proteína possui aspectos estruturais característicos das astacinas, os quais são relevantes para a atividade destas enzimas. Os resultados obtidos da clonagem e expressão da LALP3 em vetor pET20b+ mostraram que a utilização de diferentes condições de temperatura, concentração de indutor e meio de cultura não permitiram a obtenção da proteína recombinante na condição solúvel. Desta forma, foi realizada a clonagem e expressão da LALP3 em vetor pET-SUMO, o qual permite a adição da etiqueta de solubilidade SUMO à proteína de interesse. Dentre as condições avaliadas foi verificado que as expressões utilizando as cepas de E. coli SHuffle T7 Express LysY e BL21 STAR (DE3) One Shot resultaram na proteína recombinante na condição solúvel. Após a purificação da LALP3 obtida na cepa SHuffle T7 Express LysY foram realizados testes de atividade, os quais mostraram que a LALP3 obtida não apresentou atividade sobre moléculas de fibrinogênio, azocaseína e colágeno tipo I desnaturado (gelatina). Como conclusão tem-se que os passos de purificação devem ser refinados para livrar a amostra de contaminantes e que outras estratégias podem ser utilizadas, como técnicas de refolding mais elaboradas e o emprego de sistemas de expressão utilizando organismos eucarióticos.

Abstract: The venom from spiders of Loxosceles genus composed of several classes of biologically active molecules with toxic or enzymatic action. Among these toxins serinoproteases, phopholipases, hyaluronidases and astacin-like metalloproteases stand out. Astacins are secreted enzymes and are associated to events involving homeostasis; ovulation and fertilization; embryogenesis, as in tissue morphogenesis; cell migration and proliferation; cell cycle progression and apoptosis; among others. During envenomation, the role of the metalloproteases on the bite site is probably related to Extracelular Matrix degradation, being considered possible spreading factors. Through molecular biology studies it was possible to characterize three isoforms of astacin-like metalloproteases from Loxosceles intermedia, named LALP1, LALP2 and LALP3. From these, only LALP1 was cloned and obtained through heterologous expression. It was demonstrated that LALP1 is able to degrade extracellular matrix components, such gelatin, fibrinogen and fibronectin. Also, recent data showed that astacin-like proteases constitute a family of genes in spiders of Loxosceles genus and new isoforms are likely to be found. Therefore, the objective of this work was to carry out the cloning and heterologous expression of a new isoform of metalloprotease present in L. intermedia venom though molecular biology techniques, aiming for future possibilities of structural and functional studies of this protein. The three dimensional structure prediction of LALP3 revealed that the protein has structural aspects characteristic of astacins, which are important for the activity of such enzymes. The results obtained from the cloning and expression of LALP3 in pET20b+ vector depicted that different conditions of temperature, inductor concentration and culture medium did not yield the soluble protein. Therefore, the cloning and expression of LALP3 in pET-SUMO vector, which allows de addition of the solubility tag SUMO, were carried out. Among the conditions evaluated it was verified that the expressions using the E. coli strains SHuffle T7 Express LysY and BL21 STAR (DE3) One Shot yielded the soluble protein. After the purification of LALP3 obtained using the strain SHuffle T7 Express LysY activity tests were performed, which showed that LALP3 was not able to hydrolyze fibrinogen, azocasein and type I denatured collagen (gelatin) molecules. In conclusion it is stated that purification steps must be refined in order to free the sample from contaminants and other strategies can be used, as elaborated refolding techniques and the employment of expression systems using eukaryotic organisms.