Mecanismos para indução da tolerância imunológica após transferência gênica no fígado do rato gunn

Abstract

Resumo: A síndrome de Crigler-Najjar tipo I (CN-1) é uma doença hepática hereditária recessiva rara caracterizada pela ausência completa da bilirrubina-uridina-difosfatoglucuronil transferase (B-UDPGT1A1), resultando em níveis elevados de bilirrubina não conjugada. Terapia gênica para doenças hereditárias do fígado requer eficiente transferência e constante expressão do gene que codifica a proteína terapêutica nos hepatócitos. Na última década, a eficácia da transferência gênica no fígado no rato Gunn (modelo animal da CN-1) foi avaliada. Uma resposta imune contra a proteína terapêutica impediu a correção a longo prazo do fenótipo. A indução de tolerância à proteína codificada pelo transgene é fundamental para se alcançar cura completa e definitiva de uma doença genética. Para atingir este objetivo, foi explorado duas abordagens. No capítulo I, a geração de quimerismo molecular hematopoiético através do transplante de células tronco da medula óssea expressando hB-UDPGT1A1, no rato Gunn foi avaliado. Células transduzidas com vetor lentiviral contendo o transgene hBUDPGT1A1 foram injetadas em ratos receptores irradiados. Seis semanas após o transplante, o quimerismo molecular (<1%) no sangue total e avaliação da bilirrubinemia (>80 µM) foram realizados. Posteriormente, hepatócitos em regeneração foram transduzidos após hepatectomia parcial usando vetores retrovirais contendo o mesmo transgene. Os níveis de bilirrubina foram avaliados mensalmente. Tolerância à proteína terapêutica foi observada somente em 1 rato quimérico após transferência gênica in vivo no fígado. Nos capítulos II e III a transferência gênica em ratos recém-nascidos foi realizada. Ratos Gunn de 2 dias de idade receberam pela veia temporal, vetores retrovirais (capítulo II) ou lentivirais (capítulo III) contendo o gene hB-UDPGT1A1. A bilirrubinemia foi monitorada 6 semanas após e a seguir mensalmente. Em 6 semanas, a bilirrubinemia foi completamente normalizada (3 µM) e permaneceu com valores normais (<10 µM) por mais de 40 semanas. Grandes quantidades de diglucuronídeos de bilirrubina estavam presentes na bile. Análises por PCR and Western Blot confirmaram a presença e expressão da hB-UDPGT1A1 quase exclusivamente no fígado. Este trabalho representa a primeira demonstração de uma correção completa e permanente da hiperbilirrubinemia no rato Gunn, por intermédio de vetores retrovirais e lentivirais.

Abstract: Crigler-Najjar syndrome (CN-1) is a rare recessive inherited liver disease characterized by complete absence of bilirubin-uridin-diphosphate-glucuronosyl transferase (B-UDPGT1A1) resulting in high levels of unconjugated bilirubin. Gene therapy for inherited liver diseases requires the efficient transfer and sustained expression of a gene encoding the therapeutic protein into hepatocytes. During the last decade, the efficiency of liver gene transfer in Gunn rat (animal model of CN-1) was evaluated. An immune response directed against the therapeutic protein precluded long term correction of the phenotype. Tolerization to the protein encoding by a transgene is mandatory to achieve complete and definitive cure of a genetic disease. To achieve this goal, it was explored two approaches. In the chapter I, the generation of hematopoietc molecular chimerism using transplantion of hB-UDPGT1A1-transduced bone marrow stem cells in Gunn rats was evaluated. Transduced cells by lentiviral vectors harbouring hB-UDPGT1A1 transgene were injected into irradiated recipients rats. Six weeks after transplantation, the molecular chimerism (< 1%) on whole blood cells and an evaluation of bilirubinemia (> 80 µM) were performed. Thereafter, regenerating hepatocytes were transduced after partial hepatectomy using retroviral vectors carrying the same transgene. The bilirubin levels were evaluated monthly. Tolerance to the therapeutic protein was observed only in one chimeric rat after retroviral-mediated in vivo delivery to the liver. In the chapter II and chapter III, the gene transfer to newborn rats was evaluated. Two-day old newborn Gunn rats were injected via temporal vein with hB-UDPGT1A1-retroviral (chapter II) or lentiviral vectors (chapter III). Bilirubinemia was monitored at 6 weeks and monthly thereafter. At 6 weeks, bilirubinemia was completely normalized (3 µM) and remained in the normal range (< 10 µM) for more than 40 weeks. Large amounts of bilirubin glucuronides were present in the bile. PCR and Western Blot analysis confirmed the presence and expression of hB-UDPGT1A1 almost exclusively in the liver. This work represents the first demonstration of a complete and permanent correction of hyperbilirubinemia in Gunn rats using retroviral and lentiviral vectors.